高效液相色譜法測(cè)定4種烏頭中藥中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿

梁嘉豪,路曉君,師燕華,王 濤,胡 萌,贠克明,崔海燕

(山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院毒物分析教研室,晉中 030600;*通訊作者,E-mail:hycui1985@126.com)

烏頭屬中藥在中國(guó)和其他一些亞洲國(guó)家被廣泛用于治療多種疾病[1-3],尤其在我國(guó)分布較廣泛[4]。研究表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕等藥理特性[1,5]。川烏、草烏等作為中醫(yī)臨床常用中藥,具有良好的藥效,也常用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛麻木、心腹冷痛、寒疝等癥[6]。烏頭類中藥中含有劇毒成分,其中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿這3種物質(zhì)既是有效成分,又是毒性成分[7]。由于其良好的藥理活性,民間常自行炮制藥酒,導(dǎo)致自殺、他殺行為以及服藥過量導(dǎo)致中毒死亡案件時(shí)有發(fā)生;另外烏頭堿在體內(nèi)吸收代謝迅速,形同隱形殺手,給法醫(yī)鑒定帶來了很大的困難[8]。同時(shí)其治療量與中毒量非常接近[9],導(dǎo)致中醫(yī)臨床安全用藥受限。目前采用高效液相色譜法分別檢測(cè)4種烏頭屬中藥中烏頭生物堿含量已有文獻(xiàn)報(bào)道[10-12],但將這4種烏頭屬中藥同時(shí)測(cè)定進(jìn)行含量測(cè)定比較的未見報(bào)道。因此本研究通過對(duì)4種烏頭屬中藥中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量測(cè)定比較,不僅可以為有效評(píng)價(jià)及控制中藥及炮制品的質(zhì)量和保證臨床用藥的安全性提供理論依據(jù),還可為有關(guān)烏頭屬中藥中毒的科學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

1260高效液相色譜儀(美國(guó)AgiLent公司)包括安捷倫色譜工作站和紫外檢測(cè)系統(tǒng)、電子天平(德國(guó)賽多利斯Sartorius)、超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司)、MiLLiporeSimpLicity185超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)、中藥粉碎機(jī)(鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)。

生川烏、制川烏中藥材(四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司),草烏、制草烏中藥材(安徽濟(jì)順中藥飲片有限公司);標(biāo)準(zhǔn)品烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿(四川省維克奇生物科技有限公司);乙腈為色譜純,研究用水為超純水,研究中的所有其他試劑為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱的選擇:ZORBAX Eclipse Plus C18柱,流動(dòng)相A:10 mmol/L乙酸銨水溶液,流動(dòng)相B:乙腈(72 ∶28),等度洗脫模式,流速:1.5 ml/min,柱溫:35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):232 nm,進(jìn)樣量:10 μl。

1.3 溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 取一定量的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過精密稱量后分別取1 mg,各置于1.5 ml離心管中,并各加1 ml乙腈溶液于離心管中定容,搖勻,得濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品母液。

1.3.2 待測(cè)樣品溶液制備 取4個(gè)批次的烏頭類藥材生川烏、生草烏、制川烏和制草烏,分別于粉碎機(jī)中粉碎后過60目篩,裝于自封袋中密封好。各取1 g生川烏、生草烏、制川烏、制草烏的粗粉放于50 ml離心管中,一式三份,然后各加入15 ml的25%氨水,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1 ∶1)混合溶液25 ml,稱定其質(zhì)量,生川烏分別為35.8,35.5,35.4 g,生草烏分別為35.1,35.7,35.1 g,制川烏分別為34.8,35.4,35.3 g,制草烏分別為35.3,35.3,35.1 g,在功率為300 W,頻率為40 kHz,水溫在25 ℃的條件下進(jìn)行超聲處理30 min,再次稱定質(zhì)量,減失的質(zhì)量用異丙醇-乙酸乙酯(1 ∶1)混合溶液補(bǔ)足,搖勻,用濾紙進(jìn)行過濾。精密量取續(xù)濾液15 ml,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上38 ℃濃縮至干,剩余殘?jiān)芯芗尤胍译嫒芤?.5 ml溶解,取濾液,得待測(cè)樣品溶液。

1.3.3 待測(cè)樣品含量測(cè)定 采用1260高效液相色譜儀在“1.2”色譜條件下和“1.3.2”待測(cè)樣品制備下,對(duì)4種烏頭屬中藥中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

采用1260高效液相色譜儀在“1.2”色譜條件下和“1.3”待測(cè)樣品制備下,對(duì)4種烏頭屬中藥中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含量測(cè)定進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的考察。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察 精密量取濃度為500 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別稀釋成濃度為2.5,5,10,25,50,100,200,250 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,各置于1.5 ml進(jìn)樣瓶中,在“1.2”的色譜條件下,進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)建立3種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4.2 精密度考察 精密吸取濃度為500 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,稀釋成濃度為5,50,200 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別置于1.5 ml進(jìn)樣瓶中,在“1.2”的色譜條件下,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣3次,進(jìn)行精密度考察。

1.4.3 穩(wěn)定性考察 精密量取濃度為500 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別稀釋成濃度為5,50,200 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,各置于1.5 ml進(jìn)樣瓶中,在“1.2”的色譜條件下,分別在24,48,72 h時(shí)進(jìn)樣,考察穩(wěn)定性。

1.4.4 重復(fù)性考察 精密量取“1.3.2”中制備而成的待測(cè)樣品溶液1 ml,分別置于1.5 ml進(jìn)樣瓶中,在“1.2”的色譜條件下,平行3次進(jìn)樣,進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖

在“1.2”的色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣品生川烏溶液中3種生物堿峰都能得到很好的分離效果，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿的保留時(shí)間分別為14.293,18.063,20.306 min(見圖1)。生川烏溶液中次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿的保留時(shí)間分別為13.960,17.742,20.052 min(見圖2)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Figure 1 The HPLC of standard products

圖2 生川烏溶液中色譜圖Figure 2 The HPLC of wild aconite roots

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

三種生物堿化合物中，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的回歸方程在2.5-250 μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(見表1)。

表1 三種生物堿的線性方程及線性范圍Table 1 The linear equations and linear range of the three alkaloids

2.3 精密度

烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿這3種有效成分的RSD值滿足RSD<15%的要求[13](見表2),表明本研究的精密度良好。

表2 方法精密度的考察Table 2 The precision of the established method

2.4 穩(wěn)定性

烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿RSD值滿足RSD<15%的要求[13],結(jié)果表明三種物質(zhì)在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(見表3)。

表3 方法穩(wěn)定性的考察Table 3 The stability the established method

2.5 樣品含量測(cè)定

按照回歸方程進(jìn)行3批次樣品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的測(cè)定,結(jié)果表明在4種烏頭屬中藥中只有生川烏中含有3種烏頭生物堿成分(見表4)。

表4 四種烏頭屬中藥中3種生物堿的含量Table 4 The contents of three alkaloids in four kinds of aconitine

2.6 重復(fù)性

由上述“2.5”得出,僅生川烏中含有3種烏頭生物堿成分,因此對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性考察。同一批次樣品,平均分成3份,平行測(cè)定。測(cè)得烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿3種有效成分含量的RSD值滿足RSD<15%的要求[13](見表5),結(jié)果表明所測(cè)定條件的重復(fù)性良好。

表5 生川烏中3種生物堿含量Table 5 The content of three alkaloids in Radix Aconitae

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相的選擇上本研究分別進(jìn)行了水:甲醇、水:乙腈、0.1%三乙胺水溶液:甲醇、0.1%三乙胺水溶液:乙腈、10 mmol/L乙酸銨水溶液:乙腈,上述5組流動(dòng)相溶液系統(tǒng)的色譜分析,結(jié)果表明采用水:甲醇、水:乙腈、0.1%三乙胺水溶液:甲醇、0.1%三乙胺水溶液:乙腈作為流動(dòng)相時(shí),3種生物堿色譜峰分離效果不佳;采用10 mmol/L乙酸銨水溶液:乙腈作為流動(dòng)相時(shí),3種生物堿可以達(dá)到完全的分離效果,用時(shí)較短,且系統(tǒng)分離效果良好[14]。因此研究中采用10 mmol/L乙酸銨水溶液:乙腈作為本研究的流動(dòng)相。

3.2 定容溶劑的選擇

本研究分別考察了甲醇溶液和乙腈溶液對(duì)樣品分析的影響。結(jié)果表明甲醇溶液定容效果不如乙腈溶液佳,乙腈溶液溶解效果更好,溶劑效應(yīng)低,因此選擇乙腈溶液作為定容溶劑。

3.3 色譜柱的選擇

研究中考察了ZORBAX Eclipse Plus C18和ZORBAX Eclipse XDB-C18兩種色譜柱的性能。結(jié)果表明,使用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱時(shí),能使出峰時(shí)間提前,并使3種烏頭生物堿達(dá)到完全分離的目的,因此選用ZORBAX Eclipse Plus C18柱作為本研究的色譜柱。

3.4 洗脫的方式

洗脫方式是影響色譜分離的重要因素之一,本研究中分別考察了梯度洗脫與等度洗脫兩種方式。結(jié)果表明,梯度洗脫分離效果較差,3種物質(zhì)的色譜峰無分離或沒有達(dá)到完全分離;而以等度洗脫的方式進(jìn)樣時(shí),發(fā)現(xiàn)3種物質(zhì)的色譜峰分離效果較梯度洗脫好,且達(dá)到了良好的分離效果,最后考察了不同比例的等度洗脫方式10 mmol/L乙酸銨水溶液 ∶乙腈(50 ∶50,45 ∶55,60 ∶40,65 ∶35,70 ∶30),發(fā)現(xiàn)等度洗脫方式10 mmol/L乙酸銨水溶液 ∶乙腈在70 ∶30處有較為良好的分離效果,最后經(jīng)逐級(jí)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)等度洗脫比例為10 mmol/L乙酸銨水溶液 ∶乙腈為72 ∶28時(shí),洗脫效果最佳。故選擇此洗脫比例方式。

3.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于測(cè)定時(shí)所使用的待測(cè)樣品中通常含有最大吸收波長(zhǎng)各不相同的多種化合物,因此檢測(cè)的靈敏性尤為重要,應(yīng)選擇樣品溶液中大多數(shù)化合物均有的吸收波長(zhǎng)去記錄圖譜。研究中發(fā)現(xiàn),3種生物堿在220-240 nm范圍內(nèi)的紫外吸收較強(qiáng),綜合考慮了HPLC洗脫中基線的漂移等因素,最后選擇232 nm作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.6 流速的選擇

確定以10 mmol/L乙酸銨水溶液 ∶乙腈=72 ∶28作為流動(dòng)相與洗脫方式的條件下,分別考察了流速為0.8,1.0,1.5 ml/min時(shí)色譜峰的保留時(shí)間。結(jié)果表明,在流速為1.5 ml/min的情況下,3種生物堿的色譜峰分析時(shí)間較短,故綜合考慮選擇1.5 ml/min作為進(jìn)樣流速。

3.7 臨床應(yīng)用價(jià)值

烏頭類中藥中含有多種生物堿成分,而其中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿既是主要活性成分,同時(shí)也是毒性成分。在選取的4種中藥材中,制川烏和制草烏分別為生川烏和生草烏的炮制品,使用建立的方法分別對(duì)生川烏、生草烏、制川烏、制草烏4種烏頭中藥進(jìn)行了含量測(cè)定,結(jié)果表明生川烏中3種生物堿均含有,且新烏頭堿含量最高,其次為次烏頭堿、烏頭堿。而生川烏、制草烏、制川烏未完全都測(cè)定出3種生物堿,考慮可能與藥材的產(chǎn)地、采摘時(shí)間以及炮制方法不同等因素有關(guān)。結(jié)果還表明,生川烏和生草烏中3種主要生物堿的含量都較對(duì)應(yīng)炮制品高,故如何炮制使其生藥中毒性含量降低,達(dá)到穩(wěn)定、可控,是保證臨床上用藥安全與有效的關(guān)鍵因素[15]。

3.8 法醫(yī)學(xué)鑒定意義

烏頭屬中藥中3種烏頭生物堿活性成分毒性劇烈,中毒量與治療量非常接近[9],除了誤食、誤用造成中毒原因外,還有些不法分子以此類中藥投毒導(dǎo)致他殺事件的發(fā)生,且因其毒性大,在體內(nèi)代謝較快,給案件的偵查帶來了很大的挑戰(zhàn)。本研究選用的4種烏頭屬中藥中僅有生川烏中3種烏頭生物堿成分均含有。基于此,在后續(xù)開展的有關(guān)烏頭堿中毒的法醫(yī)毒物分析研究中,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的灌胃藥材我們選用生川烏。通過研究烏頭生物堿在中毒動(dòng)物體內(nèi)的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)規(guī)律,從而為此類中藥中毒的法醫(yī)學(xué)案件偵破提供提供參考依據(jù)。