以微流控芯片為載體的神經血管單元三細胞共培養模型的構建與鑒定

羅 翰， 舒偉良， 蔡 川， 陳 希， 陳 艷， 褚曉凡

神經血管單元(neurovascular unit，NVU)體外細胞培養模型的構建是目前的研究熱點，其難點是神經元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞的共培養，多數學者采用誘導干細胞分化為功能細胞或混合培養各種要素細胞的方式模擬神經血管單元的生理特點[1～3]，這無法實現平面或三維空間上以星形膠質細胞為橋梁連接其他兩種要素細胞的真實構架(神經元-星形膠質細胞-腦微血管內皮細胞)。本文介紹了一種以微流控芯片為載體、星形膠質細胞為橋梁連接神經元和腦微血管內皮細胞的新型體外三細胞共培養方法。

1 材料與方法

1.1 試劑、耗材和實驗細胞 高糖DMEM培養基、Neurobasal培養基、B27因子、L-谷氨酰胺、胎牛血清(FBS)、Hank’s 平衡鹽溶(HBSS)、EDTA、牛血清蛋白(BSA)均購自Gibco公司；多聚-D-賴氨酸、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)均購自Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自Hyclone公司；青霉素/鏈霉素(PS)、LIVE/DEAD?Cell Imaging Kit均購自Life公司；兔抗小鼠β-微管蛋白(TUJ-1)抗體、兔抗小鼠血管假性血友病因子(VWF)抗體、雞抗小鼠膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、山羊抗兔Alexa Fluor?594 IgG二抗、山羊抗雞Alexa Fluor?594 IgG二抗、封閉用山羊血清、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購自Abcam公司；4%多聚甲醛、0.1% triton X-100均購自上海凌峰化學試劑有限公司；細胞計數板購自Brand公司。微流控芯片由中國科學院深圳先進技術研究院醫工所實驗室制作。原代大腦皮質神經元、傳代培養大腦皮質星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞(bEnd.3細胞系)均購自ATCC細胞庫。

1.2 神經血管單元3種要素細胞的生長曲線繪制 (1)將神經元接種于96孔的酶標板中，第2天開始測定，之后每隔2 d測定一次吸光度，共測定7次數據，每次測定3孔，取平均值以減少誤差，橫軸表示培養時間，縱軸表示OD值，最終繪制出神經元的生長曲線；(2)取第3代傳代星形膠質細胞和bEnd.3重懸后接種于18塊芯片中，24 h后用細胞計數板對芯片的細胞進行計數，每次用3塊芯片取平均值，以后每隔24 h計數一次，連續計數6 d。根據細胞計數結果，以單位細胞的個數(105個/ml)為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.3 芯片內神經血管單元三細胞共培養模型的建立以及免疫熒光染色鑒定 芯片內中間的主流道接種星型膠質細胞，左側的主流道接種神經元；右側的主流道接種腦微血管內皮細胞，中間的主流道與兩側主流道之間通過10 μm的孔徑進行溝通，實現3種要素細胞間的直接聯系(見圖1)。芯片設計與制作方案見本小組已發表的研究成果[4]。簡要步驟如下：制備神經血管單元三細胞共培養芯片，并對芯片進行預處理。用DMEM+10% FBS+1% PS培養基重懸神經元至細胞密度為5×106～10×106個/ml，PBS漂洗3遍，左側主流道均勻鋪滿神經元，4 h后換Neuronbasal+B27+1%PS+L-谷氨酰胺神經元培養基，2 d后換液，以后每12 h換液，4 d后神經元已進入指數生長期，準備接種星形膠質細胞。用DMEM+10%FBS+1%PS培養基重懸星形膠質細胞至細胞密度為3×105～8×105個/ml，2 h后更換培養基，以后每24 h換液，觀察到星形膠質細胞已進入指數生長期，準備接種腦微血管內皮細胞。用DMEM+10%FBS+1%PS培養基重懸腦微血管內皮細胞至細胞密度為1×105～5×105個/ml，2 h后更換培養基，以后每24 h換液，之后換成注射泵控制培養基，在明場下觀察共培養細胞的生長狀態。取模型建立后3種要素細胞共培養4 d后的芯片，去除培養液，PBS漂洗，包被、穿膜、封閉后分別用TUJ-1一抗(兔抗小鼠TUJ-1抗體1∶500加入10%封閉液)、GFAP一抗(雞抗小鼠GFAP抗體1∶500加入10%封閉液)、VWF一抗(兔抗小鼠VWF抗體1∶200加入10%封閉液)處理；二抗山羊抗兔Alexa Fluor?488 IgG和山羊抗雞Alexa Fluor 594 IgG避光搖床孵育20 min；加入DAPI染色液避光作用2 min；免疫熒光顯微鏡下觀察3種要素細胞共培養的連接情況，并拍照。

圖1 神經血管單元3種要素細胞培養模式圖

1.4 芯片內培養3種要素細胞的細胞活力測定 簡要步驟如下：避光將LIVE Green(A)加入到DEAD Red(B)中，充分混勻配成2X備用液。將2X備用液與培養基1∶1混合，加入到待檢細胞中。用免疫熒光顯微鏡觀察拍照，并統計芯片中每種細胞的細胞活力，具體實驗方法如下：(1)實驗組取18塊芯片如前所述建立神經血管單元共培養(Tri-culture)模型，進行神經元-星形膠質細胞-腦微血管內皮細胞三細胞共培養;(2)對照組各取18塊芯片分別在共培養接種相應細胞的同一時間點依次單種培養(Mono-culture)神經元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞;(3)共培養模型建立后，在共培養第2天、第3天、第4天3個時間點每次各取6塊芯片，用LIVE/DEAD試劑盒測定實驗組與對照組神經元、星形膠質細胞或腦微血管內皮細胞各自的細胞活力；(4)用重復測量的方差分析分別比較實驗組與對照組之間神經元、星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞各自的細胞活力有無差異。設定檢驗水準為α=0.05，當P<0.05認為有統計學差異，統計軟件采用SPSS 23.0。

2 結 果

2.1 神經元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞的生長曲線 (1)神經元生長曲線圖示神經元在提取后0～4 d內，細胞生長處于潛伏期；4～10 d內，細胞生長最快，細胞胞質豐滿，突觸充分延伸，并互相交織成網，進入指數增長期；10 d后細胞生長停滯，進入平臺期。(2)星形膠質細胞生長曲線圖示星形膠質細胞接種后經過1 d的潛伏期進入指數增長期；1～5 d內，細胞生長最快，細胞均勻鋪滿芯片底部，細胞形狀不規則，胞質豐滿，突觸充分伸展；5 d后細胞生長停滯，進入平臺期。(3)bEnd3生長曲線圖示bEnd.3細胞系接種后經過1 d的潛伏期進入指數增長期；1～4 d內，細胞生長最快，細胞均勻鋪滿芯片底部，細胞形狀規則，胞質豐滿，呈鋪路石樣均勻排列；4 d后細胞生長停滯，進入平臺期(見圖2)。

圖2 A：神經元生長曲線圖;B：星形膠質細胞生長曲線圖;C：bEnd3生長曲線圖

2.2 芯片內神經元-星形膠質細胞-腦微血管內皮細胞三細胞共培養以及免疫熒光染色鑒定 明場下觀察神經血管單元三細胞共培養過程(見圖3)，其中幾個要點為：(1)當A細胞進入指數增長期后再接種B細胞能使A、B細胞更好的適應所處微環境；(2)兩種不同要素細胞不宜同一時間點混合接種；(3)先前接種的細胞較后來接種細胞能更好的適應共培養的條件，宜先接種增殖能力弱的細胞。免疫熒光顯微鏡下觀察神經血管單元3種要素細胞芯片內共培養的情況(見圖4)。

圖3 A：第1天接種神經元；B：神經元經過4 d左右的潛伏期，進入指數增長期，第5天接種星形膠質細胞;C：星形膠質細胞經過1 d左右的潛伏期，進入指數增長期，第6天接種bEnd.3;D：第7天 bEnd.3也以開始均勻鋪開生長，神經血管單元三細胞共培養模型正式建立

圖4 神經血管單元3種要素細胞共培養4 d后的免疫熒光染色。A：左側的綠色熒光為神經元的特異性標記物TUJ-1，右側的紅色熒光為星形膠質細胞的特異性標記物GFAP;B：左側的紅色熒光為星形膠質細胞的特異性標記物GFAP，右側的綠色熒光為bEnd.3的特異性標記物VWF，藍色熒光為神經元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞的細胞核DAPI

2.3 實驗組和對照組芯片內培養3種要素細胞的細胞活力測定 (1)共培養第2天、第3天、第4天同一時間點兩組間神經元細胞活力比較的重復測量的方差分析結果表明F時間=13.897，P=0.000，有統計學差異，說明兩組神經元的細胞活力均隨著培養時間的延長而逐漸降低，而且可發現細胞活力可以與細胞的生長曲線變化趨勢不一致；F時間*分組=0.082，P=0.921，無統計學差異，說明共培養與否和時間不存在交互作用，可以單純分析共培養與否這一組間因素對神經元細胞活力的影響；F組間=4.913，P=0.062，無統計學差異，說明共培養與否對神經元的細胞活力無明顯影響(見圖5A)。(2)共培養第2天、第3天、第4天同一時間點兩組間星形膠質細胞的細胞活力比較的重復測量的方差分析結果表明F時間=0.634，P=0.541，無統計學差異，說明兩組星形膠質細胞的細胞活力與培養時間不相關；F時間*分組=0.178，P=0.838，無統計學差異，說明共培養與否和時間不存在交互作用，可以單純分析共培養與否這一組間因素對星形膠質細胞的細胞活力的影響；F組間=2.818，P=0.124，無統計學差異，說明共培養與否對星形膠質細胞的細胞活力無明顯影響(見圖5B)。(3)共培養第2天、第3天、第4天同一時間點兩組間bEnd.3細胞活力比較的重復測量的方差分析結果表明F時間=3.437，P=0.060，無統計學差異，說明兩組bEnd.3的細胞活力與培養時間不相關；F時間*分組=0.316，P=0.733，無統計學差異，說明共培養與否和時間不存在交互作用，可以單純分析共培養與否這一組間因素對bEnd.3細胞活力的影響；F組間=1.511，P=0.247，無統計學差異，說明共培養與否對bEnd.3的細胞活力無明顯影響(見圖5C)。

圖5 A：神經元實驗組(Tri-culture)與對照組(Mono-culture)的細胞活力的重復測量的方差分析;B：星形膠質細胞實驗組(Tri-culture)與對照組(Mono-culture)的細胞活力的重復測量的方差分析;C：腦微血管內皮細胞(bEnd.3細胞系)實驗組(Tri-culture)與對照組(Mono-culture)的細胞活力的重復測量的方差分析

3 討 論

神經血管單元體外細胞共培養模型被廣泛應用于腦卒中、血管性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化等常見病的研究[4～8]。本研究能利用注射泵在各流道附加可調控的流速，形成腦微血管內皮細胞生理環境所需的剪切應力，能夠更真實地模擬血液流變學效應，反應神經血管單元在體內所處的生理微環境，研究卒中、高血壓、血管夾層等疾病在發病過程中血管狹窄或血流動力學改變對神經元的損傷以及側支代償的影響。

本模型的臨床實用性體現在可以選擇神經元、內皮細胞、星形膠質細胞、其他支持細胞和白細胞等特定細胞間的聯系來模擬體內調控網絡。還可通過使用已確診患者的細胞和體液來評估藥物療效和急性損傷的信號轉導途徑或級聯反應。因為本研究所構建的神經血管單元體外共培養模型解決了神經元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞芯片內共培養的難點，并在同一平面內實現了以星形膠質細胞為橋梁，連接神經元和腦微血管內皮細胞，充分模擬神經血管單元的物理結構，為探索神經血管網絡各重要組分的相互作用和調控方式，研究神經血管單元、血-腦脊液屏障在調節人體-腦相互作用過程中所扮演的角色，發現藥物研發過程中潛在的不良反應等領域提供了新的方向。

神經血管單元其基本組成單位由神經元-神經膠質細胞-支持細胞-血管構成[7]。其中以神經元和星形膠質細胞共培養模型最為常用，包括直接接觸共培養、非直接接觸式二維共培養和以芯片或半透膜為載體的三維共培養[9]。神經元和星形膠質細胞在共培養過程中相互促進，兩種細胞共培養技術難度較低，已經廣泛應用于各種基礎實驗研究。但是在神經元和星形膠質細胞的混合培養過程中，星形膠質細胞增殖速度快，易導致神經元的生長受影響。同時許多共培養模型中，星形膠質細胞與神經元共用培養基，而Neuronbasal培養基與B27添加因子，可能對星形膠質細胞的生長、功能和信號調控產生負面影響。因此本研究采用微孔隔開兩個細胞小室，各自接受不同的培養基，既能保持神經元和星形膠質細胞之間的聯系，又能避免因星形膠質細胞過度增殖，影響神經元的生長狀態，還能避免因培養基不同對神經元或星形膠質細胞的生長或功能產生負面影響。

中樞神經系統血管的重要特點之一是形成血腦屏障，雖然腦微血管內皮細胞作為模擬血腦屏障生理結構的關鍵功能細胞，能夠表達緊密連接蛋白，具有一定的選擇通透性，體外單種細胞培養模型模擬體內的生理微環境的基礎研究也并不少見[3]。且原代腦微血管內皮細胞的分離、純化步驟復雜，培養條件苛刻，與星形膠質細胞共培養難度大，因此越來越多研究人員傾向于使用bEnd.3、RBE-4、hCMEC/D3、HUVEC等永生化的內皮細胞系來替代原代培養的腦微血管內皮細胞，甚至通過誘導多能干細胞(iPSCs)分化為腦微血管內皮細胞構建神經血管單元模型[1,3]。但是神經血管單元引入其余幾種功能細胞能夠更接近體內血腦屏障的結構和功能特點，星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞共培養能顯著增加緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的表達，限制葡聚糖的滲透，增加跨內皮細胞電阻(trans-endothelial electrical resistance，TEER)，增強血腦屏障的功能[10]。

本研究則通過芯片10 μm微孔連通兩個相鄰的細胞小室，星型膠質細胞的終足突可通過微孔與腦微血管內皮細胞之間的緊密連接接觸，更真實地模擬血腦屏障在人體內的解剖學特點。同時本研究在微流控芯片的細胞小室中附加流動性，使內皮細胞產生生理意義的適當極化，更真實地展現腦微血管內皮細胞生理微環境所需的剪切應力，用于分析血管狹窄或血流動力學改變時腦微血管內皮細胞在血腦屏障調控中的重要作用。

以往的神經血管單元體外共培養模型主要用于血腦屏障藥物通透性篩選、血腦屏障特異性蛋白的表達、腦微血管內皮細胞轉運機制和信號調控等方面的研究，因而腦微血管內皮細胞結構和功能的完整性在其模型構建與評價體系中尤為重要。盡管有研究認為芯片內培養腦微血管內皮細胞需要8～15 d才能擁有血腦屏障功能[11]，多數模型3種要素細胞的接種順序依次為腦微血管內皮細胞(或者誘導具有選擇性通透功能的其他內皮細胞)、星形膠質細胞、神經元[8,11,12]，但筆者認為腦微血管內皮細胞的血腦屏障功能與其他要素細胞的接種時機并無直接關聯，無需等待腦微血管內皮細胞具有屏障功能后再接種其他要素細胞，以便節省共培養模型建立的時間，減少因培養時間過長導致細胞活力喪失或培養細胞染菌的幾率。而且本研究發現在共培養體系中先前接種的細胞較后來接種的細胞能更好的適應共培養的條件，因此筆者提出共培養體系優先選擇接種培養條件苛刻的細胞，故本研究的接種順序依次為神經元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞，這與以往的神經血管單元共培養模型存在巨大差異。細胞生長曲線反應細胞的生物學特征，每一代細胞的生長過程可大致分為潛伏期、指數增長期和平臺期，本研究發現在神經血管單元共培養體系中，當一種要素細胞進入指數增長期后，是再接種另一種要素細胞的最佳時機，盡管這個結論并未考慮不同物種細胞增殖速度的差異以及不同共培養細胞各自所需的添加因子的影響，需要更多的基礎研究進一步驗證，但也為體外細胞共培養方法提供了新的思路。

本研究仍存在一些局限性，盡管本研究成功建立了一種新型的神經血管單元體外細胞共培養模型，實現了以星形膠質細胞為橋梁通過微孔連接神經元和腦微血管內皮細胞，可觀察3種要素細胞之間的直接聯系和信號調控，但目前暫未借助電鏡或3D細胞打印技術，用量化的指標評價神經血管單元要素細胞間的物理連接情況。雖然微流控芯片3條流道間僅通過10 μm的孔徑進行溝通，星形膠質細胞的體積也遠大于10 μm，但在細胞增殖的過程中，仍可觀察到有細胞通過孔徑遷移到其他細胞小室。本研究初步確定了小鼠腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞、神經元三者共培養各要素細胞的接種密度、接種時間、接種順序和培養條件，但尚無干預因素處理后各要素細胞變化情況的應用研究論證該模型的實用價值。由于設計的芯片結構無法模擬內皮細胞環繞形成微血管的空腔結構，不能完美地提供內皮細胞極化，這導致內皮細胞間的通透性不同于生理情況下的通透性，本研究并未評估大分子在內皮細胞間的通透性以及檢測TEER和緊密連接的表達，無法確定該模型血腦屏障的功能狀態。盡管本研究目前仍存在以上局限性，需要進一步完善相關實驗研究，但該模型開創了星形膠質細胞同時連接神經元、腦微血管內皮細胞的神經血管單元模式，便于后續基礎研究工作者使用電鏡、3D細胞打印技術等方法觀察細胞間的相互作用，而整體研究神經血管單元也將成為神經系統疾病基礎研究的必然趨勢。