亞低溫對膿毒癥心肌抑制大鼠血清TNF-α、IL-6的影響及心肌保護作用的研究

曹偉 林樂清 梁棟誠 金光勇 唐文學 王白永 王磊

[摘要] 目的 建立膿毒癥心肌抑制大鼠模型，觀察亞低溫（33.0±0.5）℃治療對膿毒癥心肌抑制大鼠不同時期血清中兩種細胞因子[（白介素（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）]的影響及其對心肌保護作用。 方法 選用雄性SD健康大鼠，利用超聲及盲腸結扎穿孔術（CLP）制作膿毒癥心肌抑制大鼠30只，隨機分為亞低溫組與常溫組，每組各15只。亞低溫組應用亞低溫治療儀進行全身物理降溫，并監測肛溫，目標肛溫為（33.0±0.5）℃;達到目標體溫4 h后進行復溫，復溫速度為0.25～0.50 ℃/h，亞低溫治療總時長持續6 h。常溫組暴露于室溫（24.0～26.0 ℃），常規處理。兩組大鼠在0、3、6、16、24 h分別留取靜脈血標本，觀察TNF-α、IL-6、cTnI、NT-proBNP變化，24 h后處死并制作心肌病理切片，光鏡觀察心肌組織病理形態結構。 結果 心肌病理學及超微結構觀察顯示，常溫組較亞低溫組心肌組織更為疏松、模糊，部分心肌細胞腫脹、脂肪變，出現較多炎癥細胞浸潤，心肌間質出現充血擴張;亞低溫組血清TNF-α濃度在24 h明顯低于常溫組，差異有統計學意義（P<0.05），而各時間點兩組IL-6、cTnI、NT-proBNP變化比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;但亞低溫組IL-6高峰前移，cTnI及NT-proBNP在24 h較常溫組呈下降趨勢。 結論 亞低溫可抑制膿毒癥心肌抑制大鼠TNF-α表達，減輕炎癥反應，抑制炎癥介質的釋放，從而減輕心肌損傷。

[關鍵詞] 亞低溫;膿毒癥;心肌抑制;TNF-α;IL-6

[中圖分類號] R631.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）28-0035-05

Effects of sub-hypothermia on serum TNF-α，IL-6 and myocardial protection in rats with sepsis-induced myocardial suppression

CAO Wei1， 2? ?LIN Leqing1， 2? ?LIANG Dongcheng1? ?JIN Guangyong3? ?TANG Wenxue1? ?WANG Baiyong1? ?WANG? Lei1

1.Hangzhou Normal University， Hangzhou 311121， China;2.Intensive Care Unit， the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University， Hangzhou 310015， China;3.Intensive Care Unit， Hangzhou Geriatric Hospital， Hangzhou? 310015， China

[Abstract] Objective To establish a rat model of sepsis-induced myocardial suppression and observe the effects of sub-hypothermia （33.0±0.5）℃ treatment on two cytokines （interleukin-6， IL-6） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the serum of rats with sepsis-induced myocardial suppression at different periods and the myocardial protection effects of the treatment. Methods Healthy male Sprague-Dawley（SD） rats were selected as the study subjects. A total of 30 rats with sepsis-induced myocardial suppression were produced by treating them with ultrasound and cecal ligation and puncture （CLP）， and they were randomly divided into the sub-hypothermia group and the normothermic group， with 15 rats in each group. The sub-hypothermia treatment group underwent systemic physical cooling with sub-hypothermia therapeatic apparatus， and the anal temperature was monitored， with a target anal temperature of （33.0±0.5）℃. Re-warming was performed at 4 hours after reaching the target body temperature， with a re-warming rate of 0.25-0.50 ℃/h.The total duration of sub-hypothermia treatment lasted 6 hours. The normothermic treatment group was exposed to room temperature 24.0-26.0 ℃ and treated routinely. Venous blood samples were collected from rats in both groups at 0， 3， 6， 16 h and 24 h to observe the changes of TNF-α， IL-6， cardiac troponin-I（cTnI） and N terminal pro B type natriuretic peptide （NT-proBNP）. These rats were then killed after 24 h， and myocardial pathological sections were made. The pathological structure of myocardial tissue was observed by light microscopy. Results Myocardial pathology and ultrastructural observation showed that myocardial tissue was more loose and blurred in the normothermic treatment group than that in the sub-hypothermia treatment group. Swelling and fatty degeneration were found in some myocardial cells， along with many infiltrated inflammatory cells as well as congested and dilated myocardial interstitium. The serum TNF-α concentration in the sub-hypothermia treatment group was significantly lower than that in the normothermic treatment group at 24 h， with statistically significant difference（P<0.05）.However， there were no statistically significant differences between the two groups in the changes of IL-6， cTnI and NT-proBNP at each time point（P>0.05）. The peak of IL-6 in the sub-hypothermia treatment group was shifted forward， and cTnI and NT-proBNP showed a decreasing trend at 24 h compared with those in the normothermic treatment group. Conclusion Sub-hypothermia can inhibit the TNF-α expression， relieve the inflammatory response and inhibit the release of inflammatory mediators in rats with sepsis-induced myocardial suppression， thus reducing myocardial injury.

[Key words] Sub-hypothermia; Sepsis; Myocardial suppression; TNF-α; IL-6

膿毒癥合并心肌損傷是重癥病房常見的并發癥之一，具有很高的死亡率，決定著膿毒癥患者的預后[1]。膿毒癥發生心肌抑制的具體機制尚不明確，研究表明腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）參與且起重要作用，可以作為促炎介質導致心肌抑制（Sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）[2-3]。亞低溫治療目前廣泛應用于心肺復蘇及腦損傷神經功能的恢復，有研究證實亞低溫能減輕炎癥反應，可能有助于保護心肌[4]，因此本研究通過建立膿毒癥心肌抑制大鼠模型，研究亞低溫治療對膿毒癥心肌抑制大鼠主要炎癥因子的影響，探討亞低溫治療對心肌的保護作用及可能的機制，為膿毒癥的臨床治療提供新的依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性大鼠，質量（160±20）g[浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。在標準飼養條件下適應性喂養1周，術前24 h禁食禁水，制成膿毒癥心肌抑制模型后隨機分為亞低溫組（n=15）與常溫組（n=15）。所有程序均經杭州師范大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗材料

亞低溫治療儀與控溫毯（美國Cincinnati Sub-zero Products），Vevo 3100F型超聲診斷儀，3%戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司）。酶聯免疫吸附試驗試劑：腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白介素6（Interleukin-6，IL-6）均購自南京建成生物科技有限公司。

1.3 超聲心動圖檢測

兩組模型鼠在制作SIMD模型前后通過使用Vevo 3100F型超聲診斷儀，探頭型號MX 250，探頭頻率15～30 MHz，中心頻率21 MHz，圖像深度調至16 mm。將探頭置于胸骨左緣，記錄左心室運動圖像，選取3個心動周期測量取平均值，得到大鼠左室射血分數（LVEF）。

1.4 大鼠膿毒癥心肌抑制模型

選用雄性SD健康大鼠，對所有大鼠進行心臟超聲評估，剔除LVEF<0.5的大鼠。以盲腸結扎穿孔術（CLP）制作膿毒癥大鼠模型[5]。建模后3 h行血清學檢驗，剔除cTnI、NT-proBNP無明顯上升者，同時再次進行心臟超聲評估，LVEF<0.5%的膿毒癥大鼠模型即視為SIMD大鼠模型。

1.5 溫度控制

對膿毒癥心肌抑制大鼠模型進行編號，運用隨機數字表法隨機分為亞低溫組（n=15）、常溫組（n=15）。亞低溫組的實驗鼠運用亞低溫治療儀進行全身物理降溫，并監測肛溫，目標肛溫為（33.0±0.5）℃;亞低溫治療達到目標體溫4 h后進行復溫，復溫速度0.25～0.50℃/h。常溫組暴露于室溫（24.0～26.0 ℃），常規處理。

1.6 觀察指標

兩組模型鼠在造模成功后0、3、6、16、24 h通過眼眶留取靜脈血標本，各取0.5 mL置于聚丙烯試管，靜置20 min后，4℃離心15 min，取上清液，按試劑盒要求測定TNF-α、IL-6、cTnI、NT-proBNP。

1.7 心肌組織病理觀察

大鼠在實驗24 h后處死，取心肌組織，用2.5%戊二醛溶液固定24 h，脫水透明后石蠟包埋，脫蠟后經蘇木素-伊紅（HE）染色，取染色清晰、質量良好的切片于光鏡下觀察并將圖像錄入電腦。

1.8 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用重復測量數據的方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組炎癥指標比較

同一時間點比較：兩組TNF-α濃度在前16 h的變化不明顯，0、3、6、16 h比較，差異無統計學意義（P>0.05），亞低溫組與常溫組在16 h時TNF-α濃度均開始升高，至24 h時常溫組TNF-α濃度明顯高于亞低溫組，差異有統計學意義（P=0.005<0.05）;兩組IL-6濃度在0、3、6、16、24 h比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。常溫組于6 h開始升高，至24 h仍處于升高趨勢尚未達峰;而亞低溫組逐漸上升，至16 h達峰值。見表1～2、圖1～2。

2.2 兩組心臟指標比較

亞低溫組與常溫組血清cTnI、NT-proBNP濃度在0、3、6、16、24 h比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。兩組血清cTnI濃度變化趨勢基本相同，6 h開始升高，24 h到達峰值。亞低溫組血清NT-proBNP濃度6 h內呈下降趨勢，后逐漸升高，至24 h達峰值。常溫組16 h開始升高，至24 h達峰值。見表3～4、圖3～4。

2.3 光鏡下心肌病理學改變

亞低溫組心肌組織結構較整齊，部分細胞腫脹，可見少許炎性細胞浸潤;常溫組心肌細胞減少，排列較疏松、模糊，細胞出現明顯腫脹，部分心肌脂肪變，心肌間質水腫可見較多炎性細胞浸潤。見封三圖4。

3 討論

膿毒癥誘導的心肌抑制是膿毒癥死亡的主要因素[6]，其具體發病機制尚不十分明確。目前認為涉及炎癥反應、線粒體、內質網功能障礙、氧化應激等多個方面[7]，許多研究表明膿毒癥會產生各種心肌抑制因子，介導心肌損傷，其中最重要心肌抑制因子包括TNF-α、IL-6、溶菌酶等[8]。TNF-α是膿毒癥早期最主要的炎癥因子，與心肌收縮和舒張有關，IL-6、巨噬細胞移動抑制因子（MIF）等在膿毒癥發生時大量產生，損傷心肌細胞，抑制心肌細胞功能[9]。近年的研究表明，膿毒癥患者循環中心肌抑制因子的心肌抑制作用是心功能不全的主要原因[10]。宋欠紅等[11]研究表明利用清毒提取液降低膿毒癥大鼠血清TNF-α水平，可提高膿毒癥大鼠生存率，故降低心肌抑制因子水平，減少其釋放是減輕心肌抑制的重要途徑。

許多研究證實，左心室射血分數（Left ventricle ejection fraction，LVEF）與膿毒癥心肌損傷程度呈正相關[12]。排除其他引起LVEF下降的疾病后，可將LVEF<50%作為膿毒癥心肌抑制的診斷[13]。而超聲可以使臨床醫生確定收縮舒張功能障礙的程度，有利于早期識別與干預[14]。低溫治療能降低細胞及組織的氧耗，減輕過度的炎癥反應對組織的損害，包括淺低溫（34.1～37.0 ℃）、中低溫即亞低溫（32.0～34.0 ℃）、深低溫（28.0～32.0 ℃）[15]。有研究表明，亞低溫治療可阻止TNF-α、IL-6的釋放，而具有肝臟保護作用[16]，目前廣泛應用于心肺復蘇及腦保護領域，亞低溫對心臟的保護作用還知之甚少。故本研究在造模前后利用超聲測量EF進行大鼠篩選，更為成功地制作心肌抑制大鼠模型，在制模成功后，隨機接受亞低溫治療[目標肛溫為（33.0±0.5）℃]和常溫治療，觀察亞低溫治療對膿毒癥心肌抑制大鼠的心肌保護作用。

本研究發現，膿毒癥可導致心肌細胞損傷，心肌組織病理學可見心肌組織較疏松，模糊，細胞腫脹，部分心肌脂肪變，出現較多炎癥細胞浸潤，心肌間質出現充血擴張，病理改變明顯，而經亞低溫干預后，心肌細胞損傷程度明顯減輕，無明顯腫脹模糊，炎癥細胞浸潤較常溫組少。對比兩組心肌指標變化，兩組cTnI均在3 h開始升高，24 h達峰值，基本符合心肌損傷后cTnI的變化趨勢，但cTnI、NT-proBNP在各時間點比較，差異均無統計學意義（P>0.05），可能與亞低溫觀察時間偏短有關，但觀察兩組間變化趨勢，亞低溫組的cTnI、NT-proBNP均在24 h時較常溫組為低，并呈下降趨勢，而常溫組呈進一步升高趨勢，提示隨時間延長，亞低溫組在心肌損害及心功能保護方面仍可能進一步獲益。研究顯示，亞低溫治療聯合左西孟旦可以持續改善心臟驟停后心肌功能障礙，并減少促炎分子的釋放[17]，故可作為臨床改善膿毒癥心肌抑制的依據。而李濤等[18]在亞低溫對豬膿毒性休克時心肌的研究中發現，豬膿毒性休克發生以后，亞低溫可以延緩心肌損傷的速度，但并未減輕心肌損傷的程度。而對比兩組炎癥指標，常溫組膿毒癥心肌抑制大鼠血清TNF-α濃度在16 h開始逐漸升高，明顯高于亞低溫組，在24 h仍處高峰，而亞低溫組保持低幅平穩增高證實，膿毒癥炎癥因子激活，但TNF-α在早期未見顯著升高，常溫組在24 h時明顯高于亞低溫組，表明亞低溫干預可抑制膿毒癥心肌抑制大鼠TNF-α表達，減少TNF-α的釋放，從而可能具有心肌保護作用。Bobi等[19]的動物實驗研究提示亞低溫可通過減少心肌細胞凋亡及炎癥因子表達而減輕心肌損傷，改善心功能。對比兩組IL-6濃度變化，常溫組在6 h后開始升高，至24 h尚未高峰;亞低溫組持續升高，至16 h達高峰，各時間點兩組比較，無統計學意義（P>0.05）。但達峰值時間不同，亞低溫組較常溫組達峰前移，可能與亞低溫抑制TNF-α的表達同時進一步減弱炎癥反應激活，從而縮短炎癥風暴時間相關，Léon等[20]研究也表明亞低溫可以減少促炎和氧化反應，減少兩種細胞因子白介素（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的表達，從而能改善大鼠生存率。

綜上所述，本研究顯示膿毒癥可通過細胞因子級聯激活產生炎癥介質導致心肌細胞損傷，亞低溫可抑制細胞因子TNF-α釋放，尤其在亞低溫治療后24 h尤為顯著，同時亞低溫組較常溫組可使IL-6達峰前移，可能減弱炎癥反應的進一步加劇，從而減輕心肌抑制，并且隨時間延長更可能獲益。但本研究存在樣本數較少、以大鼠為研究對象，且亞低溫干預時間及觀察偏短等，可能導致部分研究結果差異無統計學意義。未來還需擴大樣本或更改研究動物，以進一步研究探討亞低溫對膿毒性心肌抑制的治療作用，為臨床提供更科學的理論依據。

[參考文獻]

[1] Heffernan Aaron J，Denny Kerina J.Host diagnostic biomarkers of infection in the ICU：Where are we and where are we going？[J]. Current Infectious Disease Reports，2021，23（4）.on published.

[2] Wang Yiyang，Yu Xiaohui，Wang Faqiang，et al. Yohimbine promotes cardiac NE release and prevents LPS-induced cardiac dysfunction via blockade of presynaptic α2A-adrenergic receptor[J].PLoS One，2013，8（5）：e63 622.

[3] Moniotte S，Belge C，Sekkali B，et al. Sepsis is associated with an upregulation of functional beta3 adrenoceptors in the myocardium[J].European Journal of Heart Failure，2007， 9（12）：1163-1171.

[4] Ye S，Weng Y，Sun S，et al. Comparison of the durations of mild therapeutic hypothermia on outcome after cardiopulmonary resuscitation in the rat[J].Circulation，2012， 125（1）：123-129.

[5] Li XS，Liu L，Jin YL，et al. Accompanying mild hypothermia significantly improved the prognosis of septic mice than artificial mild hypothermia[J]. American Journal of Emergency Medicine，2015，33（11）：1651-1658.

[6] 趙志伶，樊巧鷹，汪宗昱，等.膿毒癥心肌抑制的臨床表現及發病機制研究進展[J].中華危重病急救醫學，2014， 26（7）：525-528.

[7] 胡才寶，嚴靜，李莉，等.膿毒癥大鼠不同時期炎癥因子水平與心功能關系的研究[J].中華危重癥醫學雜志（電子版），2014，7（3）：166-171.

[8] 王國興，吳迪，謝苗榮，等.膿毒癥心肌損傷病理生理研究進展[J].實用休克雜志（中英文），2019，3（2）：74-77.

[9] 鄧卓軍，張春花，郭旋，等.高遷移率族蛋白-1及N-末端B型利鈉肽原血濃度評估嚴重膿毒癥患者心功能障礙可靠性的比較[J].中華麻醉學雜志，2014，34（10）：1252-1254.

[10] Deng Y，Yang Z，Gao Y，et al. Toll-like receptor 4 mediates acute lung injury induced by high mobility group Box-1[J]. Plos One，2013，8（5）：e64 375.

[11] 宋欠紅，樊睿，朱虹江，等.清毒提取液對膿毒癥大鼠血清腫瘤壞死因子α、高遷移率族蛋白1的影響[J].河北中醫，2018（4）：575-579.

[12] Martin L，Derwall M，Thiemermann C，et al. Heart in sepsis：Molecular mechanisms，diagnosis and therapy of septic cardiomyopathy[J].Der Anaesthesist，2017，66（7）：427-437.

[13] 董成貞，蘇美仙.膿毒癥心肌抑制的治療進展[J].醫學綜述，2020，26（20）：4017-4021，4026.

[14] Rumery K，Yunus F，Frishman WH. Myocardial depression in sepsis：Beneficial adaptation or sequelae that requires treatment？[J].Cardiology in Review，2020，28（5）：256-261.

[15] Jha A，Krishnan AM，Wu F，et al. Outcomes and utilization of therapeutic hypothermia in post-cardiac arrest patients in teaching versus non-teaching hospitals： Retrospective study of the nationwide inpatient sample database[J].Cureus，2020，12（8）： e9545.

[16] Li YQ，Wang Y，Song J，et al.Protective effect of mild hypothermia on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal neurons after hypoxia[J]. Molecular Medicine Reports，2013，7（6）：1859-1864.

[17] Wang CH，Chang WT，Tsai MS，et al.Synergistic effects of moderate therapeutic hypothermia and levosimendan on cardiac function and survival after asphyxia-induced cardiac arrest in rats[J]. Journal of the American Heart Association，2020，9（12）： e016 139.

[18] 李濤，林國生.亞低溫對豬膿毒性休克時心肌的影響[J].中華急診醫學雜志，2010，19（3）：269-272.

[19] Bobi J，Solanes N，Dantas AP，et al Moderate hypothermia modifies coronary hemodynamics and endothelium-dependent vasodilation in a porcine model of temperature management[J]. Journal of the American Heart Association，2020，9（3）：e014 035.

[20] Léon K，Moisan C，Amérand A，et al.Effect of induced mild hypothermia on two pro-inflammatory cytokines and oxidative parameters during experimental acute sepsis[J]. Redox Rep，2013，18（3）：120-126.

（收稿日期：2021-04-07）