Ⅱ、Ⅲ期直腸癌Ki-67 及微衛星不穩定的表達對預后的影響

周 濤

（泰州市第二人民醫院普外科，江蘇 泰州 225500）

直腸癌（rectal cancer）是消化道系統發生率較高的惡性腫瘤類型，且近年來呈現出逐年上升趨勢，致殘率、致死率較高[1]。目前直腸癌的發病機制尚未形成統一觀點，認為可能影響疾病發生與發展的高危因素包括年齡、吸煙、肥胖、飲酒、運動不足、高蛋白飲食等[2，3]。治療結腸癌的方式有手術、放療、化療、中藥治療等[4]。Ki-67 蛋白是與細胞分裂增殖密切相關的蛋白，在靜止期細胞中不表達，在增殖細胞中則有著廣泛的表達，對結腸癌患者的預后有一定的預測意義[5]。有研究顯示[6]，微衛星不穩定性與結腸癌患者的預后密切相關。基于此，本研究以2019年3 月-2021 年3 月我院收治的Ⅱ、Ⅲ期結腸癌患者共65 例為研究對象，分析Ki-67 及微衛星不穩定的表達對預后的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年3 月-2021 年3 月在泰州市第二人民醫院治療的65 例結腸癌患者作為研究對象，其中男性53 例，女性32 例；年齡30～82歲，平均年齡（60.32±6.13）歲；Ⅱ期27 例，Ⅲ期38例；腫瘤直徑≤4 cm 12 例，腫瘤直徑＞4 cm 53 例；淋巴結轉移35 例；腫瘤位置：左18 例，右47 例。本研究經醫院倫理委員會批準，患者自愿參與研究，并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：①經影像學、腸鏡、病理學等確診為Ⅱ、Ⅲ期直腸癌；②無肝、腎或其他可能影響治療及隨訪結果的疾病。排除標準：①術前接受過新輔助放療或化療；②結腸癌；③其他惡性腫瘤史；④影像學檢查發現其他部位遠處轉移；⑤精神病史或認知障礙。

1.3 方法 免疫組化法檢測錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 表達以及Ki-67 蛋白，鼠抗人MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鼠抗人Ki-67 單克隆抗體購自德泰生物科技有限公司，EnVision 免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色液、抗原修復液、PBS 緩沖液均由華北理工大學附屬醫院病理科提供。將組織石蠟切片置于65 ℃烤箱中，持續2 h，隨后常規脫蠟至水，通過蒸餾水清洗2 次，在室溫下孵育。30%H2O2室溫下孵育15 min，充分消除內源性過氧化物酶的活性，經蒸餾水沖洗后，利用PBS 浸泡5 min。之后將切片浸泡于枸櫞酸鹽緩沖液中，使用不銹鋼壓力鍋進行抗原修復，當壓力鍋出現噴氣時，等待2～3 min，利用PBS 沖洗3 次，5 min/次。添加兔抗人Ki-67 單克隆抗體，使用PBS 液按照1∶150 進行稀釋，在4 ℃環境下孵育過夜，PBS 沖洗3 次，5 min/次。加入HRP 標記二抗工作液50 μl，室溫下孵育60 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次。DAB 顯色試劑盒進行顯色，在顯微鏡下觀察結果，蒸餾水洗滌終止顯色反應，蘇木素復染，1%酒精鹽酸分化，自來水返藍，蒸餾水洗滌，脫水、透明、封片。Ki-67 陽性標準：以腫瘤細胞核染色為陽性，在高倍鏡（400）下選擇10 個視野進行計算，增值指數（PI）=（陽性腫瘤細胞數/總瘤細胞數）×100%，PI＜10%為陰性，PI≥10%為陽性。微衛星不穩定評價標準：任意一項錯配修復蛋白表達缺失即為微衛星不穩定，否則為微衛星穩定。

1.4 觀察指標 分析微衛星不穩定性、Ki-67 與直腸癌臨床特征的關系及其對直腸癌生存期的影響。

1.5 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行分析，計量資料使用（）表示，采用t檢驗；計數資料使用[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 錯配修復蛋白以及Ki-67 表達情況 MLH1 表達缺失11 例，MSH2 表達缺失14 例，MSH6 表達缺失8 例，PMS2 表達缺失7 例。Ki-67 表達陽性48 例，陰性17 例。

2.2 微衛星不穩定性與直腸癌臨床特征的關系 微衛星不穩定性與腫瘤直徑、淋巴結轉移以及TNM 分期有關（P＜0.05），見表1。

表1 微衛星不穩定性與直腸癌臨床特征的關系[n（%）]

2.3 微衛星不穩定性對直腸癌生存期的影響 微衛星不穩定性患者總生存期為（32.05±8.55）個月，高于微衛星穩定性患者的（22.43±9.53）個月，差異有統計學意義（t=4.684，P=0.000）。

2.4 Ki-67 與直腸癌臨床特征的關系 Ki-67 與腫瘤直徑、淋巴結轉移以及TNM 分期有關（P＜0.05），見表2。

表2 Ki-67 與直腸癌臨床特征的關系[n（%）]

2.5 Ki-67 對直腸癌生存期的影響 Ki-67 陽性患者總生存期為（31.47±7.16）個月，高于Ki-67 陰性患者的（23.21±9.54）個月，差異有統計學意義（t=3.712，P=0.000）。

3 討論

直腸癌是臨床中常見的消化道惡性腫瘤。直腸癌的位置深入盆腔，解剖關系較為復雜，手術治療雖然能取得一定的療效，但難以達到徹底消除的效果，術后復發率較高[7]。中下段直腸癌與肛管括約肌較為接近，手術操作可能會對肛門功能造成一定的影響。近年來，隨著生活結構、飲食結構以及老齡化趨勢等多方面因素的影響，直腸癌的發病率呈現出逐年上升趨勢[8]。直腸癌預后是臨床中備受關注的問題，其影響因素較多，例如臨床分期、病理組織學情況、手術是否根治等，早期直腸癌術后5 年生存率較高，可達到90%，復發率僅為1.2%～4.9%，但對于Ⅱ～Ⅲ期局部進展期直腸癌，經手術、放化療等治療后，5 年生存率會下降至50%～78%[9，10]。目前普遍認為直腸癌的發病與微衛星不穩定性、Ki-67 等因素有關[11，12]。

本研究結果顯示，微衛星不穩定性與腫瘤直徑、淋巴結轉移以及TNM 分期有關（P＜0.05）。微衛星是基因組中具有高度特異性的短串聯重復序列，當錯配修復及因出現突變或發生子區甲基化時，會導致其功能下降或喪失，當重復序列插入或缺失時無法修復，從而影響微衛星的長度，導致遺傳物質不穩定性，造成細胞增殖失控，從而引發腫瘤[13，14]。有研究顯示[15]，微衛星穩定、低表達穩定相比高表達穩定患者淋巴結轉移率更高、浸潤深度更深，本次研究結果與上述研究相符。本研究還發現微衛星不穩定性患者總生存期長于微衛星穩定性患者（P＜0.05），可見微衛星不穩定性有利于延長患者生存期。也有研究提出微衛星不穩定性是獨立于其他病理指標之外，與患者預后生存密切相關的因素[16]，本次研究結果與之相似。Ki-67 是一種核蛋白，是臨床判斷細胞增殖的主要標志物，在細胞增殖的各個階段均有明顯表達，但在細胞靜止期不表達[17，18]。研究顯示[19]，Ki-67 的表達與腫瘤分級、淋巴結轉移密切相關，對判斷腫瘤預后也具有一定的價值。本研究中Ki-67 陽性患者總生存期長于Ki-67 陰性患者（P＜0.05）。Ki-67 與腫瘤直徑、淋巴結轉移以及TNM 分期有關（P＜0.05），表明Ki-67 的表達對直腸癌患者預后具有一定的評估價值，當Ki-67 處于高表達時，腫瘤的增殖速度較快，惡性程度也越高。

綜上所述，Ki-67 陰性及微衛星不穩定表達有利于延長Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者的總生存期，主要與腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM 分期有關。