光電與微生物結合的生物雜化光合體系生產聚β-羥基丁酸酯的研究進展

張 甜，王君婷，許夢瑩

(1.武漢理工大學化學化工與生命科學學院,武漢 430070;2.武漢理工大學材料科學與工程學院,武漢 430070)

近年來隨著工業的迅速發展，塑料制品的需求量與日俱增，2014年全球塑料年產量已超過3億噸[1].而化學合成塑料的自然降解耗時長、難度大.不恰當地焚燒、堆積或傾倒廢棄塑料帶來的空氣、土壤和水污染問題日益嚴重.同時，化學合成塑料的原料大多來自不可再生的化石能源.根據有關報道，2018年全球一次能源消費增長率為2.9%，碳排放量增長了2.0%，是近7年來最快增速[2].CO2等溫室氣體的大量排放也在一定程度上導致了全球氣候變暖.日益窘迫的環境污染與能源枯竭問題正受到全世界的關注，迫使人們不斷尋求可持續發展的生物可降解塑料來代替傳統塑料.

聚β-羥基丁酸酯，簡稱PHB，是一種線性高分子聚合物，作為一種儲能物質廣泛存在于微生物中[3].由于結構的高度立體規整性，PHB具有較高的結晶度(65%～75%)，具有與聚丙烯相似的力學性能[4].此外，PHB還因其良好的生物相容性和可降解性，在眾多領域取得廣泛應用，特別是作為生物可降解塑料成為了研究關注的熱點.目前，PHB主要通過微生物發酵合成[5-7].自然界中可用于生產PHB的菌株種類繁多，其中發酵水平較高且研究最多的菌株是真養產堿桿菌Ralstoniaeutropha，(又名Alcaligeneseutrophus、Cupriauidusnecator)[8].它是一種兼性化能無機自養型革蘭氏陰性菌，既能通過ED途徑(Entner-Doudoroff Pathway)利用果糖、葡萄糖酸以及其他有機酸等多種有機物異養生長，也能通過卡爾文循環(Calvin-Benson-Bassham，CBB)利用O2、CO2、H2等自養生長[9].

利用不可再生的化石能源生產合成塑料在一定程度上加劇了能源緊張局勢，同時還會帶來白色污染問題.太陽能作為一種可再生清潔能源，分布廣泛，獲取方便.因此，利用廉價的太陽光能通過光合作用將CO2還原為可降解材料為從根本上解決這些問題提供了一條有效途徑.自然界中生物體主要通過光合作用將太陽能轉化為化學能.與自然光合作用相比，包括高效光催化劑、固態光伏裝置和光電化學電池在內的人工光合系統具有更高的光吸收效率[10].但利用人工光合系統一般合成的是一些小分子化合物，如一氧化碳[11]、甲烷[12]、甲醇[13]、甲酸[14]等.而生物系統因具有具備高特異性、自我復制與修復等優良特性的生物酶則可以合成大量具有高附加值的高分子化合物[15].因此，結合兩者優點，進而構建一個人工光合系統與生物的雜化光合體系是一條具有良好發展前景的化合物合成路徑.近年來，不少研究嘗試利用生物雜化光合系統來生產生物可降解材料PHB.主要包括光催化劑協同微生物雜化光合系統和微生物電合成(microbial electrosynthesis，MES)系統.前者將具有良好生物相容性的光催化劑與特定微生物相結合，因不涉及電極、光伏電池及電解槽等設備，故其成本也相對較低；后者以CO2為底物，利用微生物實現了電能到化學能的高效轉化，且具有較高的化學品生產特異性.其外加電源可由太陽能、風能、核能、水能等清潔能源驅動，來源廣泛且可再生.將太陽光能收集裝置與MES系統結合起來，既提高了生物固碳效率，又實現了太陽光能和電能的存儲與轉化[16].本文主要綜述了利用該系統生產PHB的最新研究進展，以及存在的問題和發展方向.

1 光催化劑協同微生物雜化光合體系

該生物雜化光合體系由光催化劑與微生物組成，選用的光催化劑具有較高的光吸收效率，微生物在系統中是一種具有高選擇性的“生物催化劑”.其作用原理為光催化劑接收大于或等于其禁帶寬度的入射光子的能量后，其價帶(valence band，VB)電子躍遷至導帶(conduction band，CB)并通過某種機制直接或間接地轉變為生物還原當量(reducing equivalents，Red)，這些還原當量可以促進微生物代謝合成許多人工光合系統無法合成的復雜化合物[17].可用于生物雜化光合體系吸收太陽能的非生物系統還包括光伏電池與電解槽耦合的人工光合系統以及光電化學電池等.與之相比，該生物雜化光合體系結構簡單，在實際應用中可能更具成本優勢.

光催化劑參與的生物雜化光合作用是一個新興的，多學科交叉的研究方向.在該領域最先發展起來的是光催化劑—酶雜化光合體系.起初，科學家的研究重點在于利用光催化劑—酶雜化光合體系產氫、進行人工固碳或固氮.例如，將無機材料與光系統Ι(PSΙ)或氫化酶相耦合可實現人工產氫[18-19]；在此基礎上，將氫化酶換成甲酸脫氫酶(FDH)、甲醛脫氫酶(FaldH)和醇脫氫酶等則可以進一步生產甲酸、甲醇等小分子化學品[20-21].但該體系同時也存在著酶的提取與保存困難、光催化劑與酶的結合可能會降低酶活性、產物簡單，不能合成高附加值的長碳鏈分子化合物等問題[22].后來，科學家將具有特定代謝途徑的微生物與光催化劑結合構建了光催化劑-微生物雜化光合體系.系統發展之初，楊培東課題組率先利用熱醋穆爾氏菌(Moorellathermoacetica)與CdS結合構建了M.thermoacetica—CdS生物雜化光合體系，用以固定CO2生產乙酸[16].后來逐漸有科研工作者利用該生物雜化光合體系生產PHB.Wang等[23]構建了一個由沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris(ACCC 10649)和CdS納米粒子組成的生物雜化光合體系來還原CO2合成PHB和類胡蘿卜素.R.palustris是一種廣泛分布于自然界中的厭氧菌，具有多種新陳代謝方式，可通過光合自養、光合異養、化學自養、化學異養等四種代謝模式進行生長.在Cd2+存在的條件下，R.palustris細胞內的半胱氨酸脫硫酶會催化半胱氨酸釋放S2-至培養基中.隨后S2-與Cd2+結合生成CdS包覆在細胞表面.通過這種方法形成的CdS與R.palustris細胞緊密結合，能有效提高體系細菌密度和PHB、類胡蘿卜素的產量，且其作用效果與CdS納米粒子的含量成正相關.同時，實驗預先通過化學方法合成CdS，然后將其與天然R.palustris混合，結果發現其并不能有效提高最終的細胞密度，效果遠不如Cd2+與S2-在R.palustris細胞表面原位組裝形成的CdS—R.palustris生物雜化光合體系.由此可見，半導體-細胞界面是電子高效傳遞的關鍵.實驗進一步探究了CdS—R.palustris生物雜化光合體系促進CO2還原的潛在作用機制(圖1).在光照條件下，CdS納米粒子受光激發產生光生電子，促進還原當量和ATP的形成，形成的還原當量和ATP隨即參與細菌細胞內的CBB循環合成甘油醛3-磷酸，隨后通過胞內代謝途徑合成類胡蘿卜素和PHB.最終，R.palustris的固體生物量、類胡蘿卜素和PHB產量分別提高到了148%、122%和147%.

圖1 CdS協同R. palustris生物雜化光合體系產PHBFig.1 PHB production by hybrid photosynthetic system coupled with CdS and R. palustris

最近，本課題組也開發了一種生產PHB的新型生物雜化光合體系(圖2).該體系由石墨相氮化碳(g-C3N4)和真養產堿桿菌(Ralstoniaeutropha)組成[24].g-C3N4是一種非金屬半導體聚合物，具有合適的禁帶寬度(2.7 eV).與金屬基光催化劑相比，其合成成本低、生物相容性好、化學和熱穩定性高、且具有較高的比表面積[25].R.eutropha是目前最為常見的產PHB菌種，在營養均衡的條件下，菌株PHB積累量不及細胞干重的3%，而在碳源充足的條件下，適當限制氮源或磷源，可明顯提高菌株PHB產量[26].g-C3N4受光激發產生的光生電子促進了還原當量的生成，進而促進R.eutropha體內NADPH的再生，NADPH不僅可以直接促進乙酰乙酰輔酶A向PHB的轉化.同時，NADPH也可能參與胞內固定CO2的CBB循環，合成乙酰輔酶A.隨后，乙酰輔酶A依次經β-酮硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)和PHB合成酶(PhaC)催化，最終生成PHB[24].研究結果顯示，生物雜化光合體系中PHB產量是單獨R.eutropha產量的1.2倍，向混合體系中加入電子供體三乙醇胺(TEOA)后可將PHB產量提高至1.4倍.并且實驗檢測到參與合成PHB的電子只有一小部分來自于g-C3N4光催化產生的H2.據此，猜測g-C3N4與細菌之間的電子傳遞可能并非以H2為傳遞介質.為了探究g-C3N4光催化促進R.eutropha產PHB的原因，課題組進一步構建了g-C3N4—Catalase體系，并將其與R.eutropha結合，與單獨培養R.eutropha相比，在異養和自養的條件下，菌株的PHB產量均提高了約一倍[27].這主要是因為混合體系中Catalase通過分解附著在g-C3N4表面的H2O2，釋放被H2O2占據的催化活性位點，進而促進H2和O2的生成，而H2和O2都是R.eutropha自養生長所需要的氣體.實驗還利用電化學阻抗譜法分析了光生電子的轉移過程，結果表明g-C3N4與Catalase結合能有效降低光催化劑與微生物間的電荷轉移電阻，進而促進R.eutropha生產PHB.這在一定程度上解釋了g-C3N4—R.eutropha生物雜化光合體系提高PHB產量的原因.但目前，光生電子從g-C3N4到R.eutropha的轉移途徑仍不清晰，還需要更深入的探究.此外，實驗探究了TEOA的濃度、g-C3N4濃度及培養基的初始pH值等實驗條件對R.eutropha菌株PHB產量的影響，并對其進行了優化，最終確定其最佳實驗條件分別為：TEOA濃度0.5%，g-C3N4濃度0.5 g·L-1，初始pH值6.8[24].

圖2 g-C3N4協同R. eutropha生物雜化光合體系產PHBFig.2 PHB production by hybrid photosynthetic system coupled with g-C3N4 and R. eutropha

基于該體系發展現狀，一方面可通過材料改性進一步提高材料的光催化性能，具體包括：形貌和結構調控[28-29]、元素摻雜[30-32]、貴金屬沉積[33-34]、構建異質結復合材料[35-36]等.另一方面，可通過基因工程提高產PHB菌株的生產能力、進一步優化產PHB菌株的培養條件等途徑來提高PHB產量.

2 微生物電合成體系

微生物電合成(microbial electrosynthesis，MES)是近10年來逐漸發展起來的一種生物電化學技術.常見的MES系統主要由陽極室和陰極室構成，兩電極浸入電解質溶液中，中間由離子交換膜(ion-exchange membrane，IEM)或鹽橋隔開.在外源電能輸入的情況下，微生物通過直接或間接的方式從電極吸收電子還原CO2合成燃料和化學品[37].MES系統由外部電源驅動，而外部電源可利用太陽能、風能等可再生能源發電.目前微生物電合成的產品以甲烷[38]、甲酸[39]、乙醇[40]、乙酸[41]、丁酸[42]等低分子化合物為主，商業價值不高.除此之外，電極與微生物之間較低的電子傳遞效率也成為了限制該技術工業化發展的瓶頸之一[43].近年來，越來越多的科學家將人工光電轉化裝置應用于微生物電合成技術生產包括PHB在內的各種化學品，取得了良好成效.

2.1 光伏電池驅動的微生物電合成

與生物的光合作用相比，太陽能光伏電池板具有很高的能量轉化效率.目前，太陽能光伏電池板光能-電能轉化效率約為18%，并且最新研究有望將其提高至40%[44].將光伏電池與MES系統相耦合，能大大提高光能到化學能的轉化效率，具有很好的能源效益.

Liu等[45]構建了一個多晶硅太陽能電池驅動的MES系統來生產PHB和C3～C5液態雜醇(圖3).實驗選用菌株同樣為R.eutropha，陽極和陰極材料分別為CoPi、Co-P合金.在外接電源的條件下，陽極水分解產生H+，e-和O2，電子通過導線從陽極流向陰極，質子則通過電解液遷移到陰極，接著H+被Co-P陰極還原為H2.當有連續CO2鼓入時，陰極處的R.eutropha捕獲H2產生還原當量，用于還原CO2.實驗過程中陰極Co-P合金電極浸出的Co2+被陽極電催化氧化為Co3+重新沉積在CoPi陽極上，進而使電解液中的Co2+的濃度始終穩定保持在較低水平，這極大地降低了金屬離子Co2+對R.eutropha的毒害作用.同時，該系統中水分解的過電位及陰極活性氧含量都得以降低.這就使得該生物雜化光合系統具有較高的能量利用效率和良好的生物相容性.用能量轉化效率為18%的太陽能電池來驅動該MES系統生產PHB，其能量利用效率可達7.6%.

圖3 光伏電池驅動微生物電合成PHBFig.3 PHB production by photovoltaic cell-driven microbial electrosynthesis

光伏電池驅動的MES系統中，光吸收裝置與微生物電合成反應器被分隔開來，有效避免了光吸收系統與微生物細胞的兼容性問題.

2.2 微生物光電化學池驅動的微生物電合成

將光催化材料引入微生物電化學系統，構建微生物光電化學池用于驅動微生物電合成是實現光能到化學能轉化的另一種途徑.在該系統中，半導體材料吸收光能促進水分解，為陰極反應提供還原當量.微生物光電化學池的結構與光電化學電池相似，均包括光陽極或光陰極又或者兩者兼而有之，區別在于微生物光電化學池含有微生物細胞，并將其作為生物催化劑用于還原CO2合成化合物，而光電化學池則不包含微生物，主要用于產氫儲能[46-50].

利用微生物光電化學池驅動微生物電合成生產化合物是一個全新的領域，Liu等[51]首次構建了一個串聯微生物光電化學池用以生產PHB(圖4).在該系統中，光陽極材料為二氧化鈦納米線，光陰極材料為硅納米線，中間由離子交換膜隔開，陰陽兩極共同構成了一個光吸收單元.陰極和光陽極均置于光照條件下，具有高比表面積的硅納米線陣列吸收光能為厭氧菌Sporomusaovata提供還原當量生產乙酸，由此產生的乙酸隨后被經過基因改造的大腸桿菌Escherichiacoli利用來生產PHB.值得注意的一點是，光電極納米陣列的存在為厭氧菌S.ovata創造了一個局部厭氧環境，使得S.ovata在有氧條件下仍然能夠正常生長并繼續還原CO2，這一點對于該系統的推廣和應用具有重要意義.同時，通過調整大腸桿菌基因改造方案，該系統還可以用來生產更多種類的化學品.實驗結果證明該系統具有低于200 mV較低的過電勢、高達90%的法拉第效率，長達200 h的穩定性，產物PHB的目標分子產率高達52%.

圖4 微生物光電化學池驅動微生物電合成PHBFig.4 PHB production by microbial electrosynthesis driven by microbial photoelectrochemical cell

一方面，微生物光電化學池驅動的微生物電合成在沒有外加電源的條件下利用光能還原CO2生產化學品，降低了電能輸入，具有極高的能源效益，為微生物電合成PHB提供了一條新的途徑.而通過外加電壓，則可以進一步提高光電極光生電子和空穴的分離效率，提高該系統光電催化活性[52-53].同時，應將外加電壓控制在適當范圍內，因為電勢過高會破壞微生物的細胞膜，對其產生不利影響[54]；電勢過低則會導致電子在電極與微生物之間傳遞緩慢，從而降低化學品生產速率和產量[55].另一方面，利用微生物光電化學池生產化合物還處在研究初期，仍然存在生產力及光能到化學能轉化效率較低等問題，如何提高該系統中的光電轉化效率以及如何降低系統優化對系統內部微生物帶來的不利影響是科學家仍需進一步探究的課題.

3 總結與展望

生物雜化光合體系提供了一個清潔、可持續、經濟高效的化學合成平臺.將該體系應用于化學品的合成是近幾年才逐漸發展起來的一項新興技術，目前有關利用生物雜化光合體系生產PHB的研究并不多.文中提到的光催化劑協同微生物雜化光合體系和MES體系實現了生物雜化光合體系生產PHB的初步探索，但要達到實際應用仍面臨著諸多挑戰.

首先，材料與生物間的能量和電荷轉移問題制約了生物雜化光合體系的進一步發展.材料與微生物間的電子傳遞機制主要有直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種.直接電子傳遞即微生物直接從材料表面獲得電子，間接電子傳遞則通過電子載體將電子傳遞給微生物細胞[56].電子載體通常是小的氧化還原介質，如H2、甲酸、NH3及Fe2+等[57].光催化劑協同微生物雜化光合體系以直接電子傳遞為主.Kornienko等[58]利用光譜分析法揭示了Moorellathermoacetica-CdS生物雜化光合體系生產乙酸過程中的兩種電子轉移途徑.第一種電子轉移途徑中，CdS受光激發產生的光電子先被膜結合的產氫酶吸收用于H2的生成，H2隨后被氧化為細胞代謝提供還原當量；第二種轉移途徑中，光電子直接通過電子轉運蛋白進入胞內參與相關酶促還原反應.鑒于電子傳遞涉及反應眾多，過程繁雜，包括R.palustris和R.eutropha在內的許多微生物與光催化劑間的電子轉移機制仍未知，需要科研人員繼續探索.MES系統中電極材料與微生物間的電子傳遞機制包括直接和間接電子傳遞兩種.電極與細胞間的直接電子傳遞一般需要膜結合的氧化還原蛋白的參與.目前，關于其電子傳遞機制的報道以對硫還原地桿菌Geobactersulfurreducens和奧奈達希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1的研究最為透徹.G.sulfurreducens和S.oneidensisMR-1均通過細胞膜上的色素蛋白實現雙向電子傳遞.通過對雙向電子傳遞過程中色素蛋白基因表達水平的對比分析，科學家發現電子從G.sulfurreducens到電極和從電極到G.sulfurreducens的傳遞過程可能是兩條完全不同的路徑[59].與之相反，對S.oneidensisMR-1的研究則表明，電子從S.oneidensis到電極和從電極到S.oneidensis可能互為逆過程[60].直接電子傳遞過程中電極與微生物細胞緊密接觸，這在一定程度上限制了底物和產物的擴散.同時，電極與細胞間的電子傳遞效率受限于電極表面積大小，阻礙了其工業化進程.但與間接電子傳遞相比，直接電子傳遞過程具有較低的過電勢，因而可實現較高的電流效率.包括S.ovata和M.thermoacetica在內的大多數產乙酸菌都能與電極進行直接電子轉移，電合成過程電子回收率可達80%[61].而R.eutropha和E.coli等已建立基因組編輯方法且具有更多樣代謝途徑的細菌只能通過電子媒介間接地從陰極吸收電子，電極與微生物細胞間的電子轉移效率較低.針對這一問題，可以通過酶的加入來構造新的電子轉移途徑，進而提高微生物細胞外電子轉移效率，提高目標產物產量.例如，Chen等[62]將甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，FDH)與中性紅(NR)介導的MES系統結合，構建了一種酶輔助的電合成系統.在該系統中，中性紅和酶催化產生的甲酸均作為電子載體為細胞提供還原當量，這極大地提高了電極與微生物細胞間的電子傳遞速度，并且有效降低了微生物電合成系統的過電勢，節約了電能.同時，研究微生物與光催化材料或電極間的電子轉移機制，也便于科學家通過生物工程技術構建新的更高效的電子轉移路徑.

另一方面，針對光催化劑光生電子-空穴對復合率高、表面活性位點有限，電極材料金屬離子浸出率高，活性氧含量過高等問題，需要對現有催化劑進行優化改性或開發出催化性能更加優良、生物相容性更好的新材料.例如，Li等[63]將Ni納米顆粒嵌入N摻雜的碳納米管合成了一種新型電催化劑Ni@N-C，將其用于MES系統作陰極電極材料，可以驅動陰極的析氫反應，進而促進R.eutrophaH16還原CO2生產PHB，改性后的材料具有更好的穩定性和生物相容性.此外，還可以通過調節pH，溫度、鹽濃度等對系統進行優化.MES系統中，鹽可以增強電解質溶液的導電性，降低溶液電阻，從而減少所需能量.最后，可利用合成生物學技術改進微生物本身的性質進而提高生物雜化光合系統的性能和效率、降低生產成本.如，通過對微生物進行基因工程改造引入新的代謝途徑，進而實現利用低成本底物合成所需產物[64-65]；或者通過調控微生物代謝途徑中的基因表達來提高產量[66-67]；還可以精簡基因組進而改變微生物生長方式，提高細胞生長速率、縮短生產周期等[68].合成生物學技術的快速發展為設計和構建優良PHB生產菌株打下了堅實的基礎，為利用生物雜化光合系統提高特定化學品產量、生產更多種類的化學品提供了一條具有良好前景的發展方向.