胃腸胰神經內分泌腫瘤中miR-124和Capn4的水平及其與化療敏感性及預后

楊瑋蔚

（鄭州第二人民醫院，河南 鄭州 450006）

胃腸胰腺神經內分泌腫瘤（GEP-NENs）為發生在胃腸道和胰腺中的罕見疾病，并表現出與常規胃腸道胰腺上皮癌不同的組織病理學特征。隨著胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤的治療和管理的不斷進步，患者的臨床癥狀可以得到很快改善，但是，該腫瘤的預后仍然很差，其5 年總生存率較低。特別是對于不能通過外科手術切除的晚期和復發性腫瘤，放化療是治療的主要方法，但是臨床效果仍然有限［1］。因此，臨床上尋找治療胃腸胰神經內分泌腫瘤的靶點及預后判斷標志物非常重要。miR-124 是一種單鏈非編碼RNA 分子，在腫瘤發生中參與并控制基因表達和細胞生物學行為［2］。研究［3］顯示，miR-124 低表達與胃癌、乳腺癌、肝細胞癌、神經膠質瘤和鼻咽癌在內的多種腫瘤發生和進展有關。鈣蛋白酶小亞基1（calpain small subunit 1,Capn4）是鈣蛋白酶的調節亞基，參與腫瘤細胞遷移，侵襲，增殖，分化和凋亡等生物學行為，已發現Capn4 在鼻咽癌、透明細胞腎細胞癌和肝內膽管癌中過表達，并與腫瘤的發生進展及預后相關［4］。研究［5］顯示，Capn4可能是miR-124 的靶基因，miR-124 通過負調控Capn4 調控腫瘤發生發展的病理過程。本研究采用定量反轉錄PCR（qRT-PCR）技術檢測癌組織及癌旁組織中miR-124、Capn4 mRNA 表達情況，免疫組化檢測Capn4 的蛋白表達，分析胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤組織miR-124、Capn4 表達水平與化療敏感性和預后的相關性，為胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤的臨床治療及預后診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009 年1 月至2015 年1 月鄭州第二人民醫院收治的91 例胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤患者。納入標準：①首次接受手術治療；②未接受化療和放療；③患者均知情并簽署知情同意書，并經鄭州第二人民醫院倫理委員會的批準。排除標準：①合并其他腫瘤疾病的患者；②伴有心、肝、腎等器官疾病的患者；③自身免疫性疾病。其中男79 例，女12 例；年齡36～84 歲，平均（61.38±7.53）歲；腫瘤位置：胃31 例，小腸24例，結腸17 例，胰腺19 例；TNM 分期，T1～T2期48 例，T3～T4 期43 例；分化程度分類：高分化46 例，中低分化45 例；發生淋巴結轉移41例，未發生淋巴結轉移50 例。收集91 例胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤患者癌組織及癌旁組織（距癌灶>3 cm 以上），并將組織置于液氮中保存。

1.2 主要試劑和儀器

UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit（南京建成生物研究所）；兔抗人Capn4 多克隆抗體（美國proteintech 公司），稀釋濃度1∶50；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒（南京建成生物研究所）；LightCycler?96 全自動熒光定量PCR 儀［羅氏診斷產品（上海）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 檢測miR-124、Capn4 mRNA 的表達 Trizol 提取組織中總RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄生成cDNA。采用UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit（2×），選取2 μL cDNA 于20 μL 反應體系行qRT-PCR。循環條件：94℃2 min；95℃15 s，60℃25 s，60℃30 s，共40 個循環。以GAPDH作為內參基因，引物序列由上海鉑尚生物科技有限公司提供。miR-124 上游序列：5′-TTAGAGGCT CTGCTCTCCGT-3′，下 游：5′-TTCACCGCGTGCC TTAATTG-3′，產物大小70 bp；Capn4 上游引物：5′-TGGAACCGACTCCCAGAACT-3′，下游：5′-G GCCGAGACTTCACGGTTT-3′，長度122 bp。內參GAPDH 上游序列 ：5′-GGATTTGGTCGTA TTGGGCG-3′，下游序列：5′-TCCCGTTCT CAGCCATGTAG-3′，長度115 bp。采用2-△△Ct法計算基因 mRNA 相對表達水平。

1.3.2 鏈霉卵白素-過氧化物酶（S-P）免疫組化染色法 將石蠟包埋的組織標本連續切片（厚度5 mm），用過氧化氫封閉內源性過氧化物酶（0.5%的甲醇溶液）15 min。在4℃下用一抗（Capn4 兔抗人抗體，以1∶50 稀釋）處理切片。將切片與生物素標記的二抗在37℃孵育10 min。每個步驟之間，用PBS 緩沖液將切片洗滌3 次，并使用DAB染色觀察免疫反應性。然后進行蘇木精復染。在陰性對照中，一抗被PBS 緩沖液代替。Capn4 以細胞漿著色為陽性細胞，由兩位病理科醫師結合染色細胞所占百分比和染色強度做出判斷。按陽性細胞所占腫瘤細胞的百分比評分：0 分（無染色細胞），1 分（<10%），2 分（10%～50%），3 分（>50%）；再按顯色程度記分：0 分（無染色細胞），1 分（細胞被染淺黃色），2 分（棕黃色），3 分（棕褐色），兩者相加≥3 分為陽性，0～3 分為陰性。

1.3.3 噻唑藍（MTT）藥敏試驗 取腫瘤組織，消化培養法進行原代細胞培養，并調整細胞濃度為1×106個/L。取細胞懸液接種于96 孔板，100μL/孔。加入藥物終濃度為藥物1次快速靜脈注射后理論最高血藥濃度的順鉑、5-氟尿嘧啶、阿霉素、絲裂霉素，同時設立對照組，置于37°C、5%CO2培養箱中培養48 h，加入50μL MTT，孵育4 h，上清液棄去，加入150μL DMSO，酶標儀570 nm 檢測吸光度。抑制率（%）=（OD 對照組-OD 實驗組）×100%/OD 對照組，其中抑制率≥30% 為敏感，<30%耐藥。

1.3.4 隨訪 門診或電話隨訪3～60 個月，末次隨訪時間為2020 年1 月，記錄患者死亡時間。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，計量資料組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，計數資料組間比較采用χ2檢驗。Pearson 進行相關性分析，應用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗進行生存分析，Cox 比例風險回歸模型分析影響患者預后因素，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-124 和Capn4 mRNA 水平比較

免疫組化染色法檢測結果提示，癌組織中miR-124 相對表達水平（0.42±0.12）明顯低于癌旁組織（1.12±0.25），差異有統計學意義（t=24.078,P<0.001）；Capn4 mRNA 在GEP-NENs 組織中的表達水平（1.39±0.42）高于癌旁組織相對值（0.68±0.15），差異有統計學意義（t=15.187,P<0.001）。

2.2 Capn4 蛋白的表達

Capn4 蛋白主要表達與細胞漿（圖1），癌旁組織Capn4 蛋白的陽性表達率為6.59%（6/91），癌組織Capn4 蛋白的陽性表達率為68.13%（62/91），癌組織Capn4 蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=73.626,P<0.001）。

圖1 Capn4 蛋白的表達（×200）

2.3 miR-124 和Capn4 mRNA 表達與臨床病理參數的關系

miR-124 的低表達和Capn4 mRNA 高表達與GEP-NENs 的淋巴結轉移、分化程度、TNM 分期相關，而與患者年齡、性別、吸煙史無關，見表1。

表1 miR-124 和Capn4 mRNA 表達與臨床病理參數的關系（例）

2.4 MTT 藥敏試驗

藥敏實驗結果顯示，胃腸胰神經內分泌腫瘤均對順鉑、5-氟尿嘧啶、阿霉素、絲裂霉素敏感，miR-124 和Capn4 mRNA 表達水平與胃腸胰神經內分泌腫瘤對順鉑、5-氟尿嘧啶敏感有關。miR-124低表達、Capn4 mRNA 高表達胃腸胰神經內分泌腫瘤細胞對順鉑、5-氟尿嘧啶敏感性低于miR-124 高表達、Capn4 mRNA 低表達的細胞（P<0.01）。而miR-124、Capn4 mRNA 表達水平與細胞對阿霉素、絲裂霉素敏感性無關（P>0.05）。見表2、表3。

表2 胃腸胰神經內分泌腫瘤對藥物的敏感性

表3 miR-124 和Capn4 mRNA 表達與胃腸胰神經內分泌腫瘤敏感性關系（）

表3 miR-124 和Capn4 mRNA 表達與胃腸胰神經內分泌腫瘤敏感性關系（）

2.5 miR-124 和Capn4 mRNA 表達的相關性

通過miRanda 檢索，顯示miR-124 和Capn4存在結合位點。Pearson 相關性分析顯示，GEP-NENs患者癌組織miR-124 和Capn4 mRNA 表達水平呈現負相關（r=-0.617,P<0.05）。見圖2、圖3。

圖2 miR-124 和Capn4 預測結合位點

圖3 miR-124 和Capn4 mRNA 表達的相關性

2.6 miR-124 和Capn4 mRNA 與胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤患者生存期的相關分析

在GEP-NENs 組織中，miR-124 低表達的患者與高表達的患者相比，總生存較差，Log-rank 法檢驗統計量，χ2=7.153,P=0.025。Capn4 高表達患者與低表達的患者相比，總生存較差，Log-rank 法檢驗統計量，χ2=8.137,P=0.019。見圖4。

圖4 miR-124 和Capn4 mRNA 高低表達患者的生存曲線

2.7 多因素Cox 回歸分析

Cox 逐步多因素分析顯示，淋巴結轉移、組織學分級、TNM 分期、miR-124 和Capn4 均是GEP-NENs患者預后的獨立影響指標。見表4。

表4 多因素Cox 回歸分析

3 討論

與以腺體形成癌為特征常見的胃腸胰腺癌不同，GEP-NENs 的特征是上皮小管腺結構的喪失，以及神經內分泌標記物分散表達。GEPNENs 大致分為兩種組織病理學亞型：胃腸道胰腺神經內分泌腫瘤（GEP-NETs）和胃腸道胰腺神經內分泌癌（GEP-NEC）［6］。GEP-NENs 的Ⅰ和Ⅱ期通常可以通過手術和放療單獨或聯合治愈。晚期GEP-NENs（Ⅲ和Ⅳ期）的患者接受手術和化學療法（單獨或聯合治療）預后不理想［7］。目前，GEP-NENs 發病的分子機制仍不清楚，從分子生物學的角度尋找治療GEP-NENs 的靶點和預后標記物是目前研究的熱點，也可以標記物的變化水平為臨床護理、診斷和治療提供參考。

miRNA（～22 bp）是不編碼蛋白質的內源RNA，但在轉錄和翻譯水平上起調節作用［8］。miRNA 可通過堿基配對與靶mRNA 的3'-非翻譯區序列結合，從而降解靶mRNA 或阻止靶mRNA 的翻譯，并在腫瘤細胞的增殖，分化和惡性轉化中發揮重要作用［9］。miR-124 在許多癌癥組織（例如肝癌）中下調，并且可以抑制腫瘤的生長［10］。吳曉燕等［11］研究發現，宮頸癌患者癌組織中miR-124 相對表達量明顯低于宮頸正常的患者的宮頸組織表達水平，與有無淋巴結轉移、TNM 分期相關，提示檢測宮頸癌組織miR-124 水平有助于判斷與患者病情和預后，同時也說明miR-124 可以作為腫瘤治療的新的靶點。本研究表明，患者癌組織中miR-124 mRNA 表達水平明顯低于癌旁組織，miR-124的低表達與GEP-NENs 的淋巴結轉移、分化程度、TNM 分期相關，而且miR-124 的低表達的患者與高表達的患者相比，總生存較差。Cox 逐步多因素分析顯示，miR-124 是GEP-NENs 患者預后的獨立影響指標，說明miR-124 參與了GEP-NENs 的發生和進展，可以作為預測GEP-NENs 預后的生物標記物，可以為臨床護理、診斷和治療提供依據。

Capn4 在腫瘤細胞中過表達，Capn4 水平高的患者預后較差，而且Capn4 表達的增加有助于局部腫瘤的侵襲和外周轉移，對腫瘤的進展有重要影響。CHENG 等［12］研究發現Capn4 在結腸癌組織中的高表達，與結腸癌患者的腫瘤進展和預后顯著相關。此外，體外實驗顯示Capn4 的表達增加增強了體外細胞的增殖，提示Capn4 在結腸癌中的致瘤作用，并可能成為結腸癌患者的潛在治療靶標。而YANG 等［13］研究發現，Capn4 表達在卵巢癌組織中顯著上調，與FIGO 分期、腫瘤等級和卵巢癌遠處轉移呈正相關。Kaplan-Meier 分析表明Capn4 高表達的患者的總生存期較短。此外，單變量Cox 回歸分析表明Capn4 過表達是卵巢癌的不利預后因素，提示Capn4 有望成為卵巢癌患者新的預后指標。基于Capn4 在維持鈣蛋白酶活性和穩定性中的重要作用以及鈣蛋白酶異常表達是癌癥的關鍵特征之一，確定Capn4 在GEP-NENs中的作用可能很重要。本研究中，患者癌組織中Capn4 mRNA 和蛋白表達水平明顯低于癌旁組織，Capn4 的高表達與GEP-NENs 的淋巴結轉移、分化程度、TNM 分期相關，而且Capn4 的高表達的患者與高表達的患者相比，總生存較差。Cox 逐步多因素分析顯示，Capn4 是GEP-NENs 患者預后的獨立影響指標，說明Capn4 參與了GEP-NENs 的發生和進展，可以為臨床護理、診斷和治療提供依據。

目前的研究表明，分析miRNAs 以及對應調控的靶基因，尋找潛在的腫瘤治療靶點是目前研究的重點內容。研究顯示，Capn4 的表達受到miR-124的負調控，可能是miR-124 的靶基因。HU 等［14］研究發現，與正常鼻咽細胞相比，鼻咽癌細胞系中Capn4 的表達升高，而miR-124 的表達降低。當預先表達miR-124 時，Capn4 表達水平下調，并進一步抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲。此外，當預先表達Capn4 時，它逆轉了miR-124 對鼻咽癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。這項研究顯示miR-124可能通過負向靶標Capn4，調控鼻咽癌的發病機理，并有望成為鼻咽癌患者的治療靶標。CAI等［15］研究發現，miR-124 在多形膠質母細胞瘤組織中顯著下調，Capn4 表達明顯上調。Spearman的相關性分析顯示miR-124 表達與Capn4 蛋白水平之間呈負相關。遷移實驗和Transwell 侵襲試驗表明Capn4 下調或miR-124 上調抑制了膠質瘤細胞的遷移和侵襲，提示miR-124 通過Capn4 在體外抑制神經膠質瘤細胞的遷移和侵襲。本研究通過Pearson 相關性分析顯示，GEP-NENs 患者癌組織miR-124 和Capn4 mRNA 表達水平呈現負相關，提示miR-124 可能通過負向調控Capn4 的表達促進GEP-NENs 細胞的發生和進展。而MTT 試驗顯示，miR-124 和Capn4 mRNA 表達水平與胃腸胰神經內分泌腫瘤對順鉑、5-氟尿嘧啶敏感有關，提示miR-124 和Capn4 可能參與胃腸胰神經內分泌腫瘤的耐藥作用，其機制可能與miR-124 調控Capn4表達水平影響細胞周期有關。利用基因技術上調miR-124 表達水平以下調Capn4 的表達，抑制GEP-NENs 癌細胞的轉移和侵襲，提高其對化療藥物敏感性，可能也是治療GEP-NENs 的潛在的方法。

總之，GEP-NENs 組織中miR-124 表達下調，Capan 蛋白水平上調，其中miR-124 負向調控Capan 蛋白的表達以促進GEP-NENs 的發生和進展，并影響其對化療藥物的敏感性，是潛在的治療靶點和預后標記物。研究miR-124 和Capan 相互關系，可以用于預測預后并指導GEP-NENs 的臨床護理、診斷和治療。