金絲桃苷對糖尿病腎病大鼠TGF-β1/smad通路及腎上皮間質轉化的影響*

王苑菲，沈美曉，吳祖榮，黃亞蓮，琚 楓，符 暢，符茂雄

（海南醫學院第二附屬醫院內分泌與代謝病科，海口 570100）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種常見糖尿病微血管并發癥，是終末期腎病的最常見病因，具有腎小球高過濾、腎臟肥大等不良表現，發展到末期可導致腎衰竭，嚴重危害患者生命健康[1-2]，金絲桃苷（Hyperoside，HP）廣泛分布于各種植物中，是一種天然黃酮醇苷類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化等多種生理作用[3]。Zhang等[4]研究報道，HP能顯著改善DN小鼠腎小球硬化從而維持腎功能的正常運轉，Zhou等[5]研究顯示，HP能顯著緩解DN大鼠腎小球過濾功能及腎臟損害并減輕早期糖尿病腎病臨床癥狀，并認為HP具有成為DA新型治療藥物的潛在價值，但關于其對DA 大鼠腎上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）影響的研究較少。因此，繼續探究DN 可能發病機制及相關治療方案仍是近年來的研究熱點。腎臟纖維化是DN 的主要病理特征，與腎功能損害密切相關[6]，資料顯示腎EMT是腎臟纖維化的初始環節之一[7-8]，鐘濤等[8]研究表明轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/smad 通路的激活與DN發展及腎EMT發生密切相關，因此本研究通過建立DN 大鼠模型，探究HP 對DN 大鼠腎EMT 及TGF-β 1/smad通路的影響，為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及設備

SPF 級雄性SD 大鼠（體質量200 g～220 g）由南京醫科大學提供（實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0001）；金絲桃苷（貨號：482-36-0，純度≥97.0%）、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號：111607-200301，純度＞98%）均購自Sigma 公司；羅格列酮片（Rosiglitazone，RGZ，批號：190106）購自成都恒瑞制藥有限公司；HE 染色試劑盒（貨號：G1121）、Masson染色試劑盒（貨號：G1340）、全蛋白提取試劑盒（貨號：BC3170）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源一抗anti-纖維連接蛋白（Fibronectin）（貨號：ab268020）、anti-E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（貨號：ab40772）、anti-α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscles actin，α-SMA）（貨號：ab5694）、anti-TGF-β1（貨號：ab215715）、anti-smad2（貨號：ab40855）、anti-smad3（貨號：ab40854）、anti-smad7（貨號：ab216428）、anti-GAPDH（貨號：ab181602），二抗羊抗兔IgG（貨號：ab6721）均購自英國Abcam 公司；動物代謝籠（型號：41800）購自意大利Ugo Basile公司；全自動生化分析儀（型號：Catalyst One）購自美國IDEXX；光學顯微鏡（型號：ContourGT-K）購自美國BRUKER 公司等。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組給藥 將60只SD大鼠隨機分為造模組（48只）和對照（NC）組（12只），DN大鼠模型的構建參考文獻[9]并稍作改動，所有造模大鼠均用高脂飼料喂養，高脂飼料中含有60%普通飼料、2%膽固醇、8%蛋黃粉、10%煉豬油、20%蔗糖，持續喂養4 周，第4 周最后一天對大鼠進行腹腔注射STZ 30 mg/kg（用0.1 mol/L 的檸檬酸緩沖液配置的1%STZ溶液）。觀察到大鼠飲水量、尿量顯著增加，出現毛色發黃、脫毛、煩躁等癥狀時，進行尾靜脈采血，于全自動生化分析儀中測定大鼠血糖值，連續3 d測血糖≥16.7 mmol/L，表明糖尿病大鼠模型構建成功；將大鼠置于動物代謝籠中繼續喂養，記錄大鼠24 h尿量并測定24 h尿蛋白，當尿量≥150%原尿量，尿蛋白量＞30 mg/24 h為DN模型構建成功。對照組正常喂養。

將造模組48 只DN 大鼠隨機分為模型（M）組、陽性藥物羅格列酮（RGZ）組、HP低（HP-L）、中（HPM）、高劑量（HP-H）組，每組12只。建模成功后24 h開始給藥，參考文獻[10]將HP低、中、高劑量組灌胃劑量分別設置為12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg；RGZ 組給藥劑量按照人體表法計算，系數采用6.25，成年人每日RGZ 用量為4 mg，則大鼠給藥劑量設置為0.4 mg/kg，NC組、M組均灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續灌胃8周。

1.2.2 標本采集 治療結束后，將大鼠放于動物代謝籠中收集各組大鼠24 h尿液，離心后收集上清液保存待檢。腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉處死各組大鼠，腹主動脈采血，低溫離心后收集血清至離心管中，低溫保存備用。對大鼠進行體表常規消毒后解剖大鼠，分離大鼠腎臟組織行后續病理學觀察及相關蛋白的免疫印記法（Western blotting，WB）檢測。

1.2.3 FBG 及血清生化指標檢測 采用全自動生化分析儀分析尿微量白蛋白（urinealbumin，UAlb）、尿肌酐（urine creatinine，Ucr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）水平。

1.2.4 各組大鼠腎臟組織病理學觀察 取1.2.2 中大鼠左側腎臟組織，從最大面切為兩部分，取其中一部分置于多聚甲醛中固定，固定好后經過不同濃度梯度的酒精溶液、二甲苯溶液進行脫水及透明處理，用石蠟進行常規包埋后行切片處理，按照蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒中的操作說明進行染色處理，將石蠟切片經過二甲苯溶液脫蠟處理，經過不同濃度的酒精溶液進行水化處理，經過蘇木素染色、返藍液返藍、伊紅染色、脫水、透明化等處理后進行封片，于顯微鏡中觀察腎臟組織病理學變化。

1.2.5 Masson染色法觀察大鼠腎臟纖維化程度

取“1.2.4”項中另一部分腎臟組織用于Masson染色，制作常病理組織切片，具體操作步驟參考Masson染色試劑盒，常規脫蠟至水，用Weigert鐵蘇木素染色液染色10 min，酸性乙醇分化液分化15 s，Masson 藍化液返藍5 min，蒸餾水沖洗1 min，麗春紅品紅染液染色10 min，依次用弱酸工作液、磷鉬酸溶液清洗，放入苯胺藍染液中染色2 min，經弱酸工作液沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明處理后用中性樹膠封固，于光學顯微鏡中觀察并拍照，根據腎臟組織纖維化面積與所選視野總面積之比計算大鼠腎臟組織纖維化面積比。

1.2.6 WB 實驗測定各組大鼠EMT、TGF-β1/smad通路相關蛋白表達水平

采用蛋白提取試劑盒提取各組大鼠右側腎組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取60 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳變性，轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，依次添加一抗anti-Fibronectin（1∶400）、anti-E-cadherin（1∶600）、anti-α-SMA（1∶500）、anti-TGF-β1（1∶1 000）、anti-smad2（1∶1 000）、anti-smad3（1∶1 000）、anti-smad7（1∶1 000）、anti-GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，添加二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，顯色、曝片，以GAPDH 為內參進行定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模組與NC組大鼠FGB及尿蛋白水平比較

與NC組比較，造模組大鼠FBG、尿蛋白水平均顯著升高（均P＜0.05），提示DN 大鼠模型構建成功，見表1。

表1 造模組與NC組大鼠FGB及24 h尿蛋白水平比較

表1 造模組與NC組大鼠FGB及24 h尿蛋白水平比較

與NC組比較，aP＜0.05。

2.1 各組大鼠FGB及生化指標水平比較

與NC 組比較，M 組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN水平均顯著升高（均P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN水平均顯著降低（均P＜0.05），HP-L 組、HP-M 組、HP-H 組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（均P＜0.05），其中HP-H組優于RGZ組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠FGB、UAlb、Ucr、BUN水平比較 n=12，

表2 各組大鼠FGB、UAlb、Ucr、BUN水平比較 n=12，

與NC組比較，aP＜0.05；與M組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L組比較，dP＜0.05；與HPM組比較，eP＜0.05。

2.2 各組大鼠腎組織病理學觀察

NC 組大鼠腎組織及腎小管結構基本正常，無明顯損害；與NC 組比較，M 組大鼠腎組織病變嚴重，出現腎小管間質炎性細胞浸潤現象，腎小球體積顯著增大且染色偏藍，腎臟纖維化面積顯著較多（均P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠腎組織形態得到明顯改善，腎臟纖維化程度顯著降低（均P＜0.05），HP 各劑量組大鼠腎組織腎臟組織損害及纖維化程度均得到明顯改善，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）。其中HP-H 組優于RGZ 組（均P＜0.05），見圖1、表3。

圖1 各組大鼠腎組織病理學觀察

表3 各組大鼠腎組織纖維化面積比 n=12，

表3 各組大鼠腎組織纖維化面積比 n=12，

與NC 組比較，aP＜0.05；與M 組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L 組比較，dP＜0.05；與HP-M 組比較，eP＜0.05。

2.3 各組大鼠腎EMT相關蛋白表達水平比較

與NC組比較，M組大鼠腎組織E-cadherin蛋白水平顯著降低，α-SMA、Fibronectin蛋白水平顯著增加（均P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠腎組織Ecadherin 蛋白水平顯著增加，α-SMA、Fibronectin 蛋白水平顯著降低（均P＜0.05），HP-L 組、HP-M 組、HP-H 組大鼠腎組織腎組織E-cadherin 蛋白水平顯著增加，α-SMA、Fibronectin 蛋白水平顯著降低，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）。其中HP-H 組優于RGZ組（均P＜0.05），見表4和圖2。

圖2 各組大鼠腎組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin 蛋白表達

表4 各組腎組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin 蛋白表達比較 n=12，

表4 各組腎組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin 蛋白表達比較 n=12，

與NC 組比較，aP＜0.05；與M 組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L 組比較，dP＜0.05；與HP-M 組比較，eP＜0.05。

2.4 各組大鼠腎組織TGF-β1/smad 通路相關蛋白表達水平比較

與NC 組比較，M 組大鼠腎組織TGF-β1、smad2、smad3 蛋白水平顯著增加，smad7 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與M組比較，RGZ組大鼠腎組織TGF-β1、smad2、smad3蛋白水平顯著降低，smad7蛋白水平顯著增加（P＜0.05），HP-L 組、HP-M 組、HP-H 組大鼠腎組織腎組織TGF-β1、smad2、smad3蛋白水平顯著降低，smad7蛋白水平顯著增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。其中HP-H 組優于RGZ 組（P＜0.05），見表5和圖3。

表5 WB檢測腎組織TGF-β1/smad通路相關蛋白表達 n=12，

表5 WB檢測腎組織TGF-β1/smad通路相關蛋白表達 n=12，

與NC組比較，aP＜0.05；與M組比較，bP＜0.05；與RGZ組比較，cP＜0.05；與HP-L組比較，dP＜0.05；與HP-M組比較，eP＜0.05。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1/smad通路相關蛋白表達

3 討論

DN 是導致糖尿病死亡的重要原因之一，目前對其發病機制仍未完全明確，與糖代謝紊亂、內質網應激和氧化應激等因素有關，腎病的不斷發展會引起腎臟纖維化程度增加、腎水腫等，嚴重時可威脅患者生命[11]。因此，探究DN 相關治療策略及可能機制仍是研究中的熱點，而建立穩定有效的DN動物模型具有重要意義，楊等[9]通過高脂飼料喂養及STZ注射成功建立DN大鼠，本研究結果顯示，與NC 組比較，M 組大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN 水平均顯著升高，與DN病情發展類似，腎組織病理學結果顯示模型組大鼠腎臟組織受到損害、纖維化程度加深，提示DN大鼠模型制備成功。

RGZ 是臨床治療DN 的常見藥物，但其療效不穩定且存在一定的肝毒性[12]。研究發現，植物中含有的多酚類、黃酮類化合物具有抗炎、降血脂及增強免疫力等多種生物活性，HP廣泛存在于各種植物中，為天然黃酮類化合物，因其分布廣泛且具有一定的藥理作用而深受研究者關注[13-14]。黃凱等[15]研究發現，HP可通過清除自由基、減少炎性因子釋放、調節T細胞亞群平衡對小鼠免疫性肝損傷發揮保護作用。Zhang 等[16]研究發現HP 可減少DN 小鼠的UAlb，改善DN 小鼠腎小球系膜基質的擴張及足細胞突起的消失，進而緩解DN 小鼠的腎臟損傷。An等[17]研究發現，HP 可減輕DN 小鼠腎小球基底膜損傷，改善其臨床癥狀，對DN小鼠腎組織有一定的保護作用。本研究結果顯示，與M組比較，經HP治療的大鼠FBG、UAlb、Ucr、BUN 水平均顯著降低，腎臟受損程度及腎臟纖維化面積均得到改善，且呈現一定的劑量依賴性，其中HP-H 組較好且優于陽性藥物RGZ 組，提示HP 可有效改善DN 大鼠血糖代謝及腎臟功能。

資料顯示，進行性腎間質纖維化是DN 的標志性病理特征，而EMT在腎間質纖維化中發揮重要作用，EMT是使極化的上皮細胞經歷多種生化變化獲得間充質細胞表型的生物學過程，在此過程中，上皮細胞的遷移、侵襲、抗凋亡能力較強，可促進細胞外基質沉積，進而加劇腎間質細胞纖維化，危害腎臟功能[18]。Yang 等[19]研究發現，YY1 高表達可通過上調α-SMA 的表達誘導EMT，進而促進糖尿病小鼠腎纖維化。EMT常以α-SMA、Fibronectin等間充質標記物過表達、E-cadherin 表達缺失等為主要特征[20]，本研究結果顯示，與NC 組比較，M 組大鼠Ecadherin 蛋白水平顯著降低，α-SMA、Fibronectin 蛋白表達水平顯著升高，提示腎EMT與腎臟纖維化聯系密切，可能參與了DN進程，與M組比較，HP各劑量組EMT相關蛋白表達水平均得到緩解，且呈現一定的劑量依賴性，其中HP-H 組較好且優于陽性藥物RGZ 組，提示HP 可能具有一定的抑制DN 大鼠腎EMT的作用。

TGF-β1 可誘導多種上皮細胞發生EMT，具有正向調控EMT的作用，是腎間質纖維化及腎小球硬化的重要細胞因子[21-22]，林等[21]研究發現，TGF-β1/smad通路激活可促進肝臟細胞EMT及肝臟纖維化進程，TGF-β1 與其受體結合形成三聚體，進而激活smad2、smad3，而smad7 可抑制TGF-β1 信號的傳導，可抑制腎EMT及腎纖維化進程。本研究結果顯示，與與M 組比較，HP 各劑量組大鼠腎組織TGF-β 1、smad2、smad3 蛋白水平顯著降低，smad7 蛋白水平顯著增加，提示HP可能通過抑制TGF-β1/smad通路激活來減輕DN大鼠腎EMT及腎纖維化程度。

綜上所述，HP 可減輕DN 大鼠腎EMT 及腎纖維化程度，可能與抑制TGF-β1/smad 通路有關。本研究初步探索HP 對DN 大鼠腎功能的保護作用及其可能機制，但HP作用機制復雜，關于其詳細藥理作用機制尚不完全明確，有待進一步深入探究。