急性心肌梗死與2型糖尿病相關(guān)差異基因的GEO芯片分析*

杜 寬，孫 悅，梁瑜禎，李爭(zhēng)明，夏 寧

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧 530007；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院，南寧 530199）

心血管疾病是我國(guó)居民死亡的頭號(hào)原因[1]。以往的研究表明，糖尿病、高膽固醇、高血壓、年齡等多種危險(xiǎn)因素都可能導(dǎo)致急性心肌梗死（AMI）的發(fā)生，特別在合并糖尿病后，臨床癥狀更復(fù)雜，治療難度更高，其死亡率進(jìn)一步加重[2-3]。糖尿病是一種常見的代謝性疾病，其特征為胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足引起的慢性高血糖。與未合并2 型糖尿病（T2DM）患者相比，AMI合并T2DM患者發(fā)病較早，心功能較差，冠脈病變支數(shù)較多，范圍較廣，易并發(fā)心力衰竭、心律失常及感染等，預(yù)后較差[2]。二者相互影響，在發(fā)病機(jī)制上有一定的相似性，關(guān)系密切[4]，均為影響人類生命健康的一大威脅，進(jìn)行早期診斷與篩查對(duì)提高患者預(yù)后至關(guān)重要。故本研究分別對(duì)AMI和T2DM的差異基因（DEG）進(jìn)行篩選，得到兩者共同的DEG，通過基因本體論（GO）和《京都議定書》的基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析、蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析、受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析，旨在篩選出連接AMI和T2DM 的具有一定診斷意義的關(guān)鍵基因，為合并兩種疾病的患者早期預(yù)測(cè)及診斷提供參考，但是具體的發(fā)病機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，查詢?nèi)掌冢?019-10-10）下載AMI和T2DM 的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，其中包括6 個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。GSE66360 數(shù)據(jù)集總結(jié)了49 例AMI患者和50例非AMI對(duì)照的基因表達(dá)譜。GSE60993數(shù)據(jù)集包含7例AMI患者和7例非AMI對(duì)照的基因表達(dá)譜。GSE20966數(shù)據(jù)集由來自10例T2DM患者和10例非糖尿病對(duì)照的基因表達(dá)譜組成。GSE25724數(shù)據(jù)集包含6 例T2DM 患者和10 例非糖尿病對(duì)照的基因表達(dá)譜。GSE38642 數(shù)據(jù)集由9 例T2DM 患者和10 例非糖尿病對(duì)照組成。GSE7014 數(shù)據(jù)集總結(jié)了20 例T2DM 患者和6 例非糖尿病對(duì)照的基因表達(dá)譜。由于GEO的數(shù)據(jù)庫(kù)是公開可用的，因此該數(shù)據(jù)未提及道德認(rèn)可。

1.2 在AMI 和T2DM 中篩選DEG 使用limma R軟件包獲得兩種疾病的DEG，包括數(shù)據(jù)集成、歸一化和匯總。通過確定|log2fold-change|≥1，可以將調(diào)整后的P＜0.05 視 為AMI 和T2DM 數(shù)據(jù)中的DEG。收集從AMI和T2DM中篩選出的DEG，使用在線分析工具Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/，查詢?nèi)掌冢?019-10-10）實(shí)現(xiàn)兩種疾病的共同基因。

1.3 常用基因功能和途徑富集分析 基于6 個(gè)數(shù)據(jù)集中的常用基因，使用Clusterprofiler R軟件包進(jìn)行GO術(shù)語和KEGG途徑分析。在GO富集分析中，包括3 個(gè)部分，即基因本體生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和中心基因的鑒定 獲取的常見基因，利用相互作用基因的檢索工具（STRING）11.0（http://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。要求的最低互動(dòng)得分設(shè)定為高置信度（0.700）。結(jié)果通過Cytoscape 3.6.1（https://cytoscape.org）可視化。為了驗(yàn)證中樞基因，使用名為cytoHubba（http：//hub.iis。sinica）的插件。已安裝Cytoscape 軟件中的edu.tw/cytohubba/）并運(yùn)行以進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件繪制ROC曲線，計(jì)算曲線下的面積（AUC）。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEG 和選定共同基因的鑒定 將GSE66360和GSE60993 的兩個(gè)AMI 數(shù)據(jù)集整合后，與正常對(duì)照組相比，在AMI 患者中鑒定出200 個(gè)DEG；將GSE20966 數(shù)據(jù)集、GSE25724 數(shù)據(jù)集、GSE38642 數(shù)據(jù)集和GSE7014數(shù)據(jù)集合并在一起并刪除重復(fù)項(xiàng)，T2DM患者與非T2DM者相比有4676個(gè)DEG，見圖1。在AMI和T2DM中共有84個(gè)共同基因，見圖2。

圖1 火山圖

圖2 糖尿病與急性心肌梗死共同差異基因的韋恩圖

2.2 共同差異基因的功能和途徑富集分析 GO結(jié)果表明，BP的變化主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化性等。在MF 部分，主要涉及受體活性和結(jié)合相關(guān)功能，如脂多糖受體活性、RAGE受體結(jié)合等。CC的變化包含與細(xì)胞膜有關(guān)的基因的大量富集，如膜組成部分、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外區(qū)域等。這些基因的KEGG通路主要在人類傳染病（結(jié)核病、利什曼病、瘧疾和百日咳）、破骨細(xì)胞分化、造血系統(tǒng)相關(guān)通路（C型凝集素受體和造血細(xì)胞譜系）和炎癥相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑（IL-17、吞噬體和Toll樣受體途徑），見圖3。

圖3 KEGG途徑富集分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及中心基因鑒定 通過STRING的在線工具和可視化軟件Cytoscape，繪制常見基因的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4）。同時(shí)，Cytoscape的cytoHubba插件也用于計(jì)算相互作用程度最高的前10 個(gè)中樞基因，即白介素1β（IL1B）、Toll 樣受體（TLR）2、Fc 受體共同γ鏈（FCER1G）、白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體亞家族B 成員2（LILRB2）、TLR4、甲酰基肽受體1（FPR1）、CD33、類骨脂素1（ORM1）、前列腺素－過氧化物過氧化物合酶2（PTGS2）和Fcγ受體II a（FCGR2A），見圖5。這些中樞基因可能成為AMI 和T2DM 的潛在靶標(biāo)。經(jīng)查詢文獻(xiàn)篩選后，選擇與兩種疾病相關(guān)討論較多的前6位的中樞基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 HUB基因的一致性百分比

2.4 排名前6 的HUB 基因在AMI 和T2DM 中的診斷價(jià)值 AUC 大小能反映潛在生物標(biāo)志物的診斷能力。在AMI患者和正常對(duì)照中，IL1B、TLR2、FCER1G、LILRB2、TLR4 和FPR1 的AUC 分別為0.835（95%CI：0.763～0.906，P＜0.001）、0.839（95%CI：0.764～0.914，P＜0.001）、0.803（95%CI：0.723～0.883，P＜0.001）、0.835（95%CI：0.763～0.906，P＜0.001）、0.869（95%CI：0.804～0.933，P＜0.001）和0.823（95%CI：0.746～0.900，P＜0.001），見圖6。

圖6 HUB基因在AMI中的ROC曲線

在T2DM 患者和正常對(duì)照中，IL1B、TLR2、FCER1G、LILRB2、TLR4 和FPR1 的AUC 分別為0.770（95%CI：0.682～0.858，P＜0.001）、0.801（95%CI：0.718～0.883，P＜0.001），0.820（95%CI：0.743～0.900，P＜0.001）、0.792（95%CI：0.703～0.880，P＜0.001）、0.798（95%CI：0.715～0.882，P＜0.001）、0.780（95%CI：0.685～0.874，P＜0.001），見圖7。

圖7 HUB基因在T2DM中的ROC曲線

3 討論

AMI 和T2DM 是全世界相當(dāng)普遍的疾病。血糖、血壓、血脂異常及高凝狀態(tài)均可使2型糖尿病患者急性心肌梗死的發(fā)生率升高，故盡早在上述方面做好預(yù)防和控制，對(duì)延緩和減少糖尿病患者心血管事件的發(fā)生是至關(guān)重要的。本研究中共從GEO 檢索了6 個(gè)數(shù)據(jù)集，與正常對(duì)照相比，獲得了AMI 和T2DM 中的84 個(gè)共同基因。通過富集分析來確定一些GO術(shù)語和KEGG途徑，在PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中選擇與AMI和T2DM有緊密關(guān)系的10個(gè)基因，并評(píng)估了排名前6 位的中樞基因的診斷效率（P＜0.001），結(jié)果顯示，上述6個(gè)基因的AUC值均大于0.7，提示其診斷能力具有較高的可靠性。這些基因可能在未來AMI 和T2DM 的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

IL1B屬于IL基因家族，是免疫炎癥機(jī)制中著名的調(diào)節(jié)劑之一[5]。先前的研究表明，在AMI 的早期階段，一些心肌細(xì)胞處于缺血狀態(tài)，IL1B 被缺血性內(nèi)皮細(xì)胞釋放，在隨后的時(shí)間里，它會(huì)逐漸被白細(xì)胞潛入心肌[6]。最近的研究表明，通過注射針對(duì)IL1B 的疫苗，可以有效地恢復(fù)胰島B 細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，并且可以明顯改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性[7]。在這項(xiàng)研究中，通過KEGG通路分析，包括了大部分與免疫相關(guān)的信號(hào)通路，如與IL1B 密切相關(guān)的IL-17 信號(hào)通路。TLR是一種蛋白質(zhì)分子，在非特異性免疫過程中起著關(guān)鍵作用[8]。Arslan 等[9]報(bào)道顯示，與野生型小鼠相比，TLR2 基因敲除（TLR2/-）小鼠的心肌梗死面積小，心臟功能改善，惡性心律失常的死亡率和發(fā)生率降低。TLRs不僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)，也在胰島β 細(xì)胞中表達(dá)。體內(nèi)胰島素抵抗可能與TLR4 信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)[10]。

FCER1G是編碼由帶有Fc R的細(xì)胞表達(dá)的IgEFc受體的γ的亞基之一[11]。有學(xué)者對(duì)健康人血小板中的全血血栓形成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FCER1G 可能被上調(diào)并影響血栓形成過程[12]。在T2DM 中，關(guān)于FCER1G的研究也很少。但是從免疫學(xué)和新陳代謝的角度來看，Igs 可以刺激脂肪生成，這被證實(shí)對(duì)人具有抗炎作用，揭示脂肪細(xì)胞上存在Fc 受體和Fc刺激的胰島素以及脂肪生成，這些因素也可能促進(jìn)了T2DM 的發(fā) 展[13]。LILRB2 屬于LILRB 亞家族，LILRBs在骨髓細(xì)胞和造血干細(xì)胞中廣泛表達(dá)，對(duì)許多免疫細(xì)胞具有抑制作用[14]。本研究KEGG 分析中，發(fā)現(xiàn)AMI 和T2DM 參與造血系統(tǒng)相關(guān)的途徑，這可能表明LILRB2 基因在其中起著重要作用。LILRB2 和T2DM 之間的關(guān)系幾乎沒有研究，大多數(shù)LILRB2研究集中在腫瘤和血液系統(tǒng)疾病。但是筆者推測(cè)，由于T2DM 與心血管疾病和微血管疾病的伴發(fā)程度較高，LILRB2 可能在這些機(jī)制中起作用，需要進(jìn)一步研究以探究?jī)?nèi)部原因。FPR1是G蛋白偶聯(lián)模式識(shí)別受體家族的成員之一，主要由哺乳動(dòng)物的吞噬細(xì)胞表達(dá)，并且參與炎癥和組織損傷[15]。研究表明，缺血再灌注損傷大鼠FPR1表達(dá)水平升高，而沉默F(xiàn)PR1表達(dá)后，大鼠心肌梗死面積減小[16]。

本研究通過生物信息學(xué)方法闡明了AMI 與T2DM 之間的潛在聯(lián)系，為深入研究二者疾病發(fā)生發(fā)展及診斷預(yù)測(cè)提供了較可靠的靶標(biāo)。然而，我們需要進(jìn)一步通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些靶基因，了解其各自特定的功能。