基于Klotho/FGF23通路探討天麻鉤藤飲對大鼠靜脈橋血管氧化應激及內膜增生的影響*

王建民，孟 蓓，王勝利，辛利軍

（河北以嶺醫院血管外科，石家莊 050000）

冠心病是常見的心血管疾病，近年來，其發病率不斷升高且呈年輕化趨勢[1]。冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）是該病治療的主要方法，能有效改善患者預后[2]。大隱靜脈（great saphenous vein，GSV）是CABG的常用移植血管，具有來源豐富、易獲取、無排斥反應等優點[3]。然而，GSV與動脈吻合后因血管內皮細胞氧化應激損傷引起血管內膜增生，進而引起靜脈橋血管再狹窄，導致遠期閉塞率較高，嚴重影響CABG 遠期療效[4]。因此，如何減少靜脈橋血管內膜增生是目前使用CABG 治療亟需解決的問題。Klotho/成纖維細胞生長因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）是參與高血壓發生發展及動脈硬化進展的常見通路，且Klotho、FGF23分別為慢性腎臟病患者頸動脈內膜、中膜厚度增厚的保護和危險因子[5-6]。天麻鉤藤飲是治療原發性高血壓疾病的經典中草藥方劑，研究表明，其作用機制與抑制氧化應激、維護血管內皮系統功能有關[7-8]。但天麻鉤藤飲對靜脈橋血管內膜增生的影響鮮有研究。本研究通過建立大鼠自體靜脈移植模型，基于Klotho/FGF23通路探討天麻鉤藤飲對大鼠靜脈橋血管氧化應激及內膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠，體重200～250 g，購于上海茂生衍生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0004，于SPF級動物房中飼養，濕度50%～60%，溫度20～25 ℃，光照12 h明/12 h 暗，自由攝食、飲水。本研究經河北以嶺醫院動物倫理委員會審核批準（審批號：201610201）

1.2 藥品 天麻鉤藤飲配制[9]：天麻9 g，鉤藤（后下）12 g，生石決明（先煎）18 g，山梔9 g，黃芩9 g，川牛膝12 g，杜仲9 g，益母草9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，朱茯神9 g。以上藥物經河北以嶺醫院中藥房鑒定均為正品，加水煎煮濃縮為1 g/mL 藥液，4 ℃保存備用。

1.3 主要試劑與儀器 Klotho 陰性對照（NC）、Klotho 小干擾RNA（siRNA）序列及Klotho、FGF23、GAPDH 引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購自美國Promega 公司；蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自上海一研生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；Klotho 抗體、FGF23 抗體、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、GAPDH 抗體、羊抗兔lgG 購自Abcam 公司。顯微鏡（型號：ⅣC TK-870E）購自日本Olympus 公司；熒光定量PCR 儀（ABI 7500）為美國Applied Biosystems 公司產品；酶標儀（型號：SynergyH 1）購自美國BioTek公司；凝膠成像系統（型號：AlphaImager Mini）購自美國Protein Simple公司。

1.4 大鼠自體靜脈移植模型建立[10]大鼠術前禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）進行麻醉。尾靜脈注射200 U/kg肝素鈉，在頸部正中切開皮膚約2 cm，找到并分離右側頸外靜脈，結扎其屬支，切取0.8～1.0 cm 遠心端主干，用肝素鈉鹽水沖洗并浸泡在罌粟堿溶液中備用。于右側氣管旁、胸鎖乳突肌下游離右頸總動脈至交叉處，期間用罌粟堿稀釋液噴灑動脈血管表面。動脈兩端用無損傷血管夾阻斷兩側血流，切除中間動脈約0.5 cm，用肝素鈉鹽水沖洗血管腔。利用“cuff”套管技術吻合頸外靜脈與頸總動脈，開放血管夾，觀察到有力的血流搏動感即為自體靜脈移植模型建立成功。洗滌手術區域，依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚，術畢當天肌注40萬U/kg青霉素抗感染。

1.5 動物分組及給藥 將造模成功的48 只SD 大鼠隨機分為模型對照組、天麻鉤藤飲組、通路對照組和通路干預組，每組12只。參照成人天麻鉤藤飲用量計算大鼠等效劑量（114 g/60 kg）×6.3≈12 g/kg[9]。天麻鉤藤飲組、通路對照組和通路干預組大鼠每日給予天麻鉤藤飲12 mL/kg灌胃，通路對照組和通路干預組大鼠每日給予Klotho NC（0.38 OD/mL）、Klotho siRNA（0.4 OD/mL）100 μL 尾靜脈注射，模型對照組灌胃等量蒸餾水，1 次/d，連續給藥28 d。

1.6 標本采集與處理 每組分別于術后2 周、4 周各隨機取6只大鼠的移植靜脈橋血管，沖洗干凈，一部分血管組織固定于4%多聚甲醛，另一部分置于液氮中保存。

1.7 HE染色觀察各組大鼠靜脈橋血管病理形態及內膜增生情況 取4%多聚甲醛固定24 h 后的靜脈橋血管組織，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片，行HE 染色。顯微鏡下觀察大鼠靜脈橋血管病理形態。使用Image-ProPlus 6.0軟件測量中段橫截面的新生內膜厚度，取平均值。

1.8 qRT-PCR法檢測大鼠靜脈橋血管組織Klotho、FGF23 mRNA表達水平 取靜脈橋血管，冰上制備勻漿，TRIzol 法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃延伸40 s，共40 個循環。引物序列如下：Klotho 上游：5’-TGATGTAGGCTGGCTGGCAGAG-3’，下游：5’-TGGTGGTGTAATGGCTCAACGC-3’；FGF23上游：5’-ATCAGAGGATGCTGGCTCCGTAG-3’，下游：5’-TAGCCGTTCTCTAGCGTCCACTG-3’；GAPDH 上游：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’，下游：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’。

1.9 ELISA 法檢測大鼠靜脈橋血管中GSH-Px 活性、MDA含量 取靜脈橋血管勻漿，離心，取上清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，測定樣本與標準品在酶標儀450 nm波長處的吸光度，繪制標準曲線，計算靜脈橋血管中GSH-Px活性和MDA含量。

1.10 Western blotting 法檢測大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA 蛋白表達 提取靜脈橋血管組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白進行10%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，濕轉法轉至聚偏氟乙烯膜上，分離目標條帶，用5%脫脂奶粉封閉60 min，加入一抗（Klotho、FGF23、PCNA、GAPDH，均1∶600稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST 洗滌；ECL 發光，成像儀中顯影、拍照，Image J軟件進行條帶灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.11 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠自體靜脈移植模型構建情況 手術過程中無大鼠死亡，48 只大鼠均順利完成手術，血管吻合口通暢，無出血、狹窄、血管扭曲等情況，術后能觀察到移植靜脈橋血管中血液充盈良好，血流搏動有力，剪斷遠心端能看到鮮紅色血液流出，表明血流通暢，大鼠自體靜脈移植模型構建成功。

2.2 4 組大鼠靜脈橋血管病理形態 HE 染色結果顯示，模型對照組術后2 周靜脈橋血管內膜細胞明顯增多，即出現增生，術后4周增生更加明顯；術后2周，天麻鉤藤飲組靜脈橋血管內膜細胞層數明顯減少，術后4周內膜增生改善更加明顯，與通路對照組內膜厚度無明顯差異；通路干預組較通路對照組內膜明顯增厚，出現再狹窄現象，見圖1。

圖1 4組大鼠靜脈橋血管病理形態（HE染色×200）

2.3 4組大鼠靜脈橋血管內膜厚度比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管內膜厚度均顯著減小（均P＜0.05）；術后2周、4周，天麻鉤藤飲組與通路對照組靜脈橋血管內膜厚度比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管內膜厚度顯著增加（均P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠靜脈橋血管內膜厚度比較 ，n=6

表1 4組大鼠靜脈橋血管內膜厚度比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

2.4 4 組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA表達水平比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho mRNA 水平顯著升高，FGF23 mRNA 水平顯著降低（均P＜0.05）；天麻鉤藤飲組與通路對照組比較，術后2周、4周靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA水平比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho mRNA水平顯著降低，FGF23 mRNA水平顯著升高（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA表達水平比較 ，n=6

表2 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23 mRNA表達水平比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

2.5 4 組大鼠靜脈橋血管中GSH-Px 活性、MDA 含量比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管中GSH-Px 活性顯著升高，MDA含量顯著降低（均P＜0.05）；術后2周、4周，天麻鉤藤飲組與通路對照組靜脈橋血管中GSH-Px活性、MDA 含量比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預組大鼠術后2周、4周靜脈橋血管中GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高（均P＜0.05），見表3。

表3 4組大鼠靜脈橋血管中GSH-Px活性、MDA含量比較 ，n=6

表3 4組大鼠靜脈橋血管中GSH-Px活性、MDA含量比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

2.6 4 組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達比較 與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術后2周、4周靜脈橋血管中Klotho蛋白水平顯著升高，FGF23、PCNA 蛋白水平顯著降低（均P＜0.05）；術后2 周、4 周，天麻鉤藤飲組與通路對照組靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA 蛋白水平比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）；與通路對照組比較，通路干預組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho 蛋白水平顯著降低，FGF23、PCNA 蛋白水平顯著升高（均P＜0.05），見圖2、表4。

表4 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達水平比較 ，n=6

表4 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達水平比較 ，n=6

與模型對照組比較，aP＜0.05；與天麻鉤藤飲組比較，bP＜0.05；與通路對照組比較，cP＜0.05。

圖2 4組大鼠靜脈橋血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表達

3 討論

盡管藥物治療、介入治療等治療可在一定程度上緩解冠心病病情發展，CABG 仍是治療冠心病的主要且有效手段，然而，術后靜脈橋血管發生再狹窄會影響橋血管的近期、遠期通暢率[11]。基礎研究顯示，靜脈移植過程中，血流切應力改變、手術操作機械性損傷、組織缺血再灌注等因素均會引起血管內皮細胞損傷，進而刺激血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子、活性氧等各種細胞因子及炎癥介質釋放，導致平滑肌細胞異常遷移、增殖，同時平滑肌細胞不斷分泌細胞外基質，使得血管內膜不斷增厚以適應動脈血流，最終導致移植靜脈再狹窄發生[12-13]。本研究采用靜脈移植手術，術中保證血管吻合口通暢，無出血等異常情況，術后可見移植靜脈橋血管中血液充盈，血流搏動有力，血流通暢，表明大鼠自體靜脈移植模型建立成功。

天麻鉤藤飲收載于《雜病證治新義》，是治療高血壓病的經典方劑，由天麻、鉤藤、生石決明、山梔、黃芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯神組成，天麻、鉤藤平肝熄風，生石決明平肝潛陽，山梔、黃芩清肝降火，川牛膝活血利水，杜仲、桑寄生補肝益腎，夜交藤、朱茯神寧心安神，合用具有平肝熄風、清熱活血、補益肝腎的功效[14-15]。馮惠枝[16]研究發現，天麻鉤藤飲能抑制患者細胞內Ca2+及炎癥因子釋放，有效改善高血壓患者血管內皮功能損傷及血管重塑。本研究建立大鼠自體靜脈移植模型后給予大鼠天麻鉤藤飲灌胃，發現術后2 周、4 周時大鼠靜脈橋血管內膜厚度均顯著減小，提示天麻鉤藤飲可以抑制靜脈橋血管內膜增生。GSH-Px、MDA 分別為重要的抗氧化酶和脂質過氧化反應最終產物，是檢測抗氧化應激水平及氧化應激水平的重要參考指標[17]。本研究結果顯示，與模型對照組比較，天麻鉤藤飲組大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管中GSH-Px 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低，提示天麻鉤藤飲可抑制氧化應激，提高機體抗氧化能力，減輕血管內皮功能損傷，進而抑制靜脈橋血管內膜增生。

Klotho/FGF23 通路是影響冠心病、慢性腎臟疾病、高血壓等疾病血管功能的重要通路[18-19]。有研究發現，Klotho蛋白水平升高能減少活性氧的產生，抑制腎臟細胞氧化應激反應[20]。陳金艷等[6]研究表明，Klotho 蛋白對血管內皮細胞具有保護作用，而FGF-23水平升高與內皮功能紊亂相關，兩者均能影響頸動脈內膜中膜厚度變化。本研究結果顯示，使用天麻鉤藤飲后，大鼠術后2 周、4 周靜脈橋血管中Klotho mRNA 及蛋白水平顯著升高，FGF23 mRNA及蛋白水平顯著降低，提示天麻鉤藤飲可能通過上調Klotho 表達并下調FGF23 表達保護血管內皮細胞。此外，本研究在使用天麻鉤藤飲治療的同時向大鼠尾靜脈注射Klotho siRNA抑制Klotho表達，發現靜脈橋血管中Klotho mRNA 及蛋白表達量顯著降低，FGF-23 mRNA 及蛋白表達量顯著升高，同時GSH-Px 活性顯著降低，MDA 含量顯著升高，血管內膜厚度顯著增加，靜脈橋血管出現再狹窄現象，進一步提示天麻鉤藤飲改善靜脈橋血管內膜增生的機制可能與上調Klotho 表達及下調FGF23 表達有關。

綜上所述，天麻鉤藤飲可能通過激活Klotho/FGF23 信號通路抑制自體靜脈移植大鼠靜脈橋血管中氧化應激反應，改善血管內膜增生。