HOXC10基因對體外人牙髓干細胞增殖和成脂分化的調控作用機制研究*

尹霜霜，李 雋

（湖南中醫藥高等?？茖W校附屬第一醫院口腔科，株洲 412000）

牙髓炎是臨床常見疾病之一，其主要是由于牙齒齲壞引起的一種炎癥反應，牙髓中革蘭陰性菌可釋放脂多糖（LPS）等多種毒性產物從而影響牙髓干細胞的生物學功能[1]。牙髓干細胞具有高度自我更新能力及多向分化能力，并可在牙髓自我修復過程中分化為牙本質細胞[2]。牙齒齲壞可影響牙髓細胞的生物學功能，而牙髓干細胞在牙體再生過程中發揮重要作用[3-4]。目前關于影響人牙髓干細胞增殖、分化能力的基因研究相對較少，因而本研究從分子水平探究基因對人牙髓干細胞增殖、成脂分化能力的影響及其調控機制。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可調控人牙髓干細胞增殖、成脂分化過程[5]。相關報道指出，HOXC10 是同源異型盒基因（homeobox genes，HOX）的家族成員，HOXC10 可促進綿羊骨髓間充質干細胞的增殖并減少脂質積累[6]。但HOXC10對體外人牙髓干細胞增殖和成脂分化的調控作用尚未闡明。因此，本研究主要探討HOXC10 在成脂誘導后人牙髓干細胞中的表達狀態，探究其對人牙髓干細胞增殖及成脂分化的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-MEM培養基購自美國Gibco；Dispase酶與Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma；Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen；si-HOXC10、si-con購自蘇州吉瑪生物；Trizol試劑購自美國Ambion；反轉錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒購自北京TaKaRa；成脂誘導液購自美國Gibco；Transwell 小室購自美國Corning；MTT購自上海晶抗生物；兔抗人HOXC10抗體購自美國Abcam公司；兔抗人PPARγ、C/EBP-α抗體購自上海鈺博生物；兔抗人GSK3β、β-catenin 抗體購自美國Cell Signaling Technology；二抗購自武漢博士德生物。牙體組織來源：收集20例本院口腔科拔除的智齒或因正畸拔牙，選取無牙體及牙周組織疾病的牙體組織，將牙體組織置于含有青霉素與鏈霉素雙抗的培養基中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 人牙髓干細胞分離培養及實驗分組 人牙髓干細胞分離培養：取出凍存牙體組織，PBS 清洗，使用無菌骨鑿、鼓錘沿著牙體長軸縱行避開牙體，取出牙髓組織，剪去根尖，置于無菌離心管內（15 mL），采用PBS沖洗，剪碎牙髓組織（1 mm3），4 ℃條件下經600 r/min離心3 min，棄上清，加入Ⅰ型膠原酶液與Dispase 酶液，37 ℃消化15 min，加入含有胎牛血清的培養基終止消化，4 ℃條件下經600 r/min離心3 min，棄上清，平鋪于培養皿底部，置于37 ℃恒溫培養箱培養，待細胞生長至80%融合時進行傳代培養[7]。取生長狀態良好的第三代細胞，待細胞生長至80%融合時，加入胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL，接種于96 孔板（100 μL/孔），分別將si-HOXC10、si-con轉染至人牙髓干細胞，分別記作si-HOXC10 組、si-con 組，同時將未經轉染的人牙髓干細胞記作NC組。轉染方法參照Lipofectamine2000試劑說明書進行操作。

1.2.2 細胞成脂誘導 采用PBS 緩沖液洗滌轉染24 h 后的人牙髓干細胞，加入0.125%胰蛋白酶消化，加入1 mL含有15%胎牛血清的培養基制備細胞懸液，調整細胞密度后接種于24孔板（6×104個/孔），置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，使用含有青霉素與鏈霉素雙抗的PBS緩沖液洗滌細胞，棄PBS，每孔加入0.8 mL 成脂誘導液，每隔3 d 更換一次成脂誘導液，誘導21 d。

1.2.3 qPCR 檢測細胞中HOXC10、PPARγ、C/EBPα mRNA 的表達水平 收集誘導前、成脂誘導后及轉染后各組人牙髓干細胞，采用Trizol 法提取細胞中的總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA 反轉錄合成cDNA，反轉錄體系：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。HOXC10 正向引物5’-ACAGACCTCAATCGCTCAGGA-3’，反向引物5’-AGGGGTAAATCTGGATACTGGC-3’；PPARγ 正向引物5’-CTGCGTCCCCGCCTTATTAT-3’，反向引物5’-GGCATTGTGAGACATCCCA-3’；C/EBP-α正向引物5’-TCACTTGCAGTTCCAGATCG-3’，反向引物5’-TTGACCAAGGAGCTCTCAGG-3’；β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，qRT-PCR反應體系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 補足體系至20 μL；反應條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循環40次），HOXC10、PPARγ、C/EBP-α均以βactin 為內參，用2-ΔΔCt法計算HOXC10、PPARγ、C/EBP-α mRNA相對表達量。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖 取對數期人牙髓干細胞每孔5×103個細胞的密度接種于96 孔板，按照“1.2.1”項實驗分組處理后，分別于成脂誘導1 d、3 d、5 d 時每孔加入MTT 試劑20 μL，繼續培養4 h，離心后棄培養基，每孔加入150 μL DMSO，應用酶標儀檢測OD。

1.2.5 Transwell 小室實驗檢測細胞遷移 收集各組人牙髓干細胞，調整細胞密度為2.5×104個/mL，向Tranwell 小室的下室加入600 μL 培養液，取100 μL 人牙髓干細胞加入Tranwell 小室的上室，Tranwell小室插入培養液中，置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，取出Tranwell 小室，吸干上室液體，轉移至含有800 μL 甲醇中，使用甲醇固定遷移到Tranwell 小室下層的細胞，固定15 min，流水沖洗，應用顯微鏡觀察遷移到膜下層的細胞，計算細胞遷移數。

1.2.6 酶標儀檢測細胞黏附能力 采用PBS 按照（1∶8）比例稀釋Ⅰ型膠原（50 mg/L），按照每孔50 μL 加入96 孔板，4 ℃條件下孵育24 h，吸出Ⅰ型膠原，PBS 洗滌，加入含有1%牛血清白蛋白，置于37 ℃恒溫培養箱培養1 h，每孔加入含有100 μL 轉染后的人牙髓干細胞的培養液，置于37 ℃恒溫培養箱培養30 min，細胞饑餓處理24 h，收集細胞置于無菌離心管內，4 ℃條件下經1 000 r/min 離心5 min，棄舊培養液，加入不含血清的培養液重懸細胞接種于96 孔板（5×104個/孔），每組設置3 個復孔，置于37 ℃恒溫培養箱培養90 min，吸出孔內培養液，PBS洗滌，采用4%多聚甲醛固定5 min，PBS 洗滌，加入0.5%甲苯胺藍染色5 min，蒸餾水洗滌，加入100 μL醋酸（33%），勻速振蕩15 min，應用酶標儀檢測各孔在595 nm 波長處的吸光度值（OD 值）。實驗重復3次。

1.2.7 Western blotting 檢 測HOXC10、PPARγ、C/EBP-α、WNT 通路相關蛋白GSK3β、β-catenin 的蛋白表達 RIPA 蛋白裂解液提取各組人牙髓干細胞總蛋白，蛋白樣品中加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。取50 μg 蛋白樣品進行10%SDS-PAGE 分離蛋白，轉膜、封閉，加入HOXC10（1∶1 000）、PPARγ（1∶800）、C/EBP-α（1∶800）、GSK3β（1∶800）、β-catenin（1∶1 000）與內參β-actin（1∶1 000）一抗稀釋液，4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗稀釋液（1:5 000），滴加ECL，暗室內曝光顯影，應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人牙髓干細胞誘導成脂分化過程中HOXC10基因表達

與成脂誘導前相比，成脂分化誘導后人牙髓干細胞中HOXC10 mRNA 及蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），PPARγ、C/EBP-α 的表達水平顯著降低（均P＜0.05），見圖1、表1。

表1 成脂分化誘導液對人牙髓干細胞成脂分化過程中HOXC10 mRNA、HOXC10mRNA、PPARγ和C/EBP-α mRNA表達 ，n=9

表1 成脂分化誘導液對人牙髓干細胞成脂分化過程中HOXC10 mRNA、HOXC10mRNA、PPARγ和C/EBP-α mRNA表達 ，n=9

圖1 人牙髓干細胞誘導成脂分化過程中HOXC10、PPARγ和C/EBP-α蛋白表達

2.2 沉默HOXC10對人牙髓干細胞活性的影響

與si-con 組相比，si-HOXC10 組人牙髓干細胞活性顯著降低（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 沉默HOXC10后人牙髓干細胞中HOXC10蛋白表達

表2 沉默HOXC10對人牙髓干細胞活性的影響 ，n=9

表2 沉默HOXC10對人牙髓干細胞活性的影響 ，n=9

與si-con組相比較，*P＜0.05。

2.3 沉默HOXC10 對人牙髓干細胞遷移和細胞黏附的影響

相較于si-con 組，si-HOXC10 組人牙髓干細胞遷移細胞數顯著增多（P＜0.05），細胞黏附能力顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 沉默HOXC10 對人牙髓干細胞對遷移和細胞黏附能力的影響 ，n=9

表3 沉默HOXC10 對人牙髓干細胞對遷移和細胞黏附能力的影響 ，n=9

與si-con組相比較，*P＜0.05。

2.4 沉默HOXC10 對人牙髓干細胞對成脂分化的影響

與si-con 組相比，si-HOXC10 組人牙髓干細胞中PPARγ、C/EBP-α 的表達水平顯著降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 沉默HOXC10 對人牙髓干細胞中PPARγ 和C/EBP-α蛋白表達的影響

2.5 沉默HOXC10對人牙髓干細胞WNT通路的影響

與si-con 組相比，si-HOXC10 組人牙髓干細胞WNT 通路中GSK3β 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），β-catenin蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 沉默HOXC10對人牙髓干細胞WNT通路GSK3β 和βcatenin蛋白的影響

3 討論

人牙髓干細胞具有多向分化的能力，在一定條件下可增殖分化為成骨細胞、脂肪細胞等多種細胞，LPS 可通過激活單核巨噬細胞而誘導牙髓系統中的細胞釋放炎癥因子從而引起宿主的炎癥反應，研究表明A20 基因沉默可抑制人牙髓干細胞增殖及分化能力[8-10]。但仍有多種基因可參與人牙髓干細胞增殖及分化過程，因而本研究探尋新型基因并分析其對人牙髓干細胞增殖及分化的影響。

HOXC10 與其天然反義轉錄物LncRNA HOXC-AS3 相互作用可調節間質/基質細胞的成骨作用[11]。HOXC10可抑制間充質干細胞的成骨分化潛能[12]。相關報道指出，HOXC10 可作為區分羊膜和蛻膜間充質干細胞的潛在標志物[13]。以上研究結果提示，HOXC10 在細胞成骨分化過程中發揮重要調控作用。本研究結果顯示，成脂誘導后人牙髓干細胞中HOXC10的表達水平顯著降低，成脂相關蛋白PPARγ、C/EBP-α 的表達量顯著降低，提示HOXC10 表達量降低可能參與人牙髓干細胞成脂分化過程。本研究結果顯示，沉默HOXC10后人牙髓干細胞增殖活力顯著降低，提示沉默HOXC10可抑制人牙髓干細胞增殖。進一步研究發現，沉默HOXC10 后人牙髓干細胞遷移能力與細胞吸附能力明顯增強，提示沉默HOXC10可促進人牙髓干細胞遷移及增強吸附能力。研究表明，成脂分化主要是指脂肪組織中的細胞增殖、分化轉換成能夠儲存脂類的細胞的過程，PPARγ、C/EBP-α表達下調可抑制成脂分化的發生[14-15]。本研究結果顯示，沉默HOXC10 表達后人牙髓干細胞中PPARγ、C/EBP-α表達水平降低，提示HOXC10 可能通過上調PPARγ、C/EBP-α 的表達從而促進人牙髓干細胞的成脂分化。

WNT 通路可調控細胞增殖、遷移，還可調控間充質干細胞及胚胎肝細胞的自我更新及分化，研究表明，WNT通路在牙齒發育及牙源性干細胞增殖分化等方面發揮重要調控作用[16]。相關報道指出GSK3β、β-catenin 是WNT 通路的主要蛋白，抑制WNT 通路可通過上調GSK3β 表達及下調β-catenin表達從而上調PPARγ、C/EBP-α 的表達進而促進牙髓干細胞的成脂分化[17]。研究表明通過下調WNT通路的表達可促進人牙髓干細胞的成骨向分化及成牙本質向分化[18]。本研究結果顯示，沉默HOXC10 后人牙髓干細胞中WNT 通路相關蛋白GSK3β 的表達水平降低，β-catenin 的表達水平升高，提示沉默HOXC10 可能通過激活WNT 通路進而抑制牙髓干細胞的成脂分化。

綜上所述，成脂誘導的牙髓干細胞中HOXC10低表達，沉默HOXC10可抑制牙髓干細胞增殖及成脂分化，并可促進牙髓干細胞的遷移及細胞黏附，其作用機制可能是通過激活WNT 通路而發揮作用，可為進一步揭示人牙髓干細胞增殖及成脂分化的分子機制奠定理論基礎。但關于HOXC10 在人牙髓干細胞增殖及成脂分化過程中的具體作用機制仍需進一步探討。