LncRNA NORAD對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子和纖維化因子表達(dá)的影響及機(jī)制研究*

盧 迪，黎 瑤，李 婷，邱 平

（四川成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，成都 610500）

糖尿病腎病是慢性腎臟病變的一種重要類型，腎小管損傷及腎纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的病理基礎(chǔ)，腎小管上皮細(xì)胞在腎損傷中發(fā)揮重要作用，不僅合成分泌各種炎癥介質(zhì)，參與調(diào)控局部炎癥免疫反應(yīng)，亦可轉(zhuǎn)化為間質(zhì)成纖維細(xì)胞參與腎間質(zhì)纖維化過程[1-3]。因此，研究高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞功能改變對探索腎損傷的機(jī)制有重大意義。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 與糖尿病腎病的發(fā)展密切相關(guān)[4]。研究報道，高葡萄糖處理的腎小球系膜細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NORAD 上調(diào)表達(dá)，NORAD通過靶向miR-520h上調(diào)TLR4促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增殖能力并抑制其凋亡，從而加重糖尿病腎病的進(jìn)程[5]。NORAD 可減輕MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞毒性，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[6]。然而，lncRNA NORAD對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中炎性和纖維化因子表達(dá)的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報道，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中miR-367異常表達(dá)[7]。miR-367通過靶向CEBPA促進(jìn)M2極化，減輕了小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥損傷[8]。心肌梗死后心臟纖維化中miR-367-3p的表達(dá)降低[9]。而miR-367-3p 對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中炎性和纖維化因子表達(dá)的影響目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA NORAD 對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中炎性和纖維化因子表達(dá)的影響及機(jī)制是否與miR-367-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2（美國ATCC）；DMEM培養(yǎng)基（美國hyclone）；D-葡萄糖、甘露醇（美國Caisson）；Trizol 試劑（美國Invitrogen）；熒光定量PCR試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（美國Biovision）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1 一抗（美國Fitzgerald）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Santa）；電化學(xué)發(fā)光（ECL）液（上海信裕生物科技有限公司）；TGF-β1、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA）（艾美捷科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國AAT Bioquest）。

1.2 細(xì)胞處理與分組

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，用終濃度為30.0 mmol/L 的D-葡萄糖培養(yǎng)HK-2 作為高糖處理組，以5.5 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對照組，以含5.5 mmol/L D-葡萄糖和24.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng)的細(xì)胞作為滲透壓對照組；將si-NC、si-LncRNA NORAD、miR-NC、miR-367-3p 轉(zhuǎn)染至HK-2 細(xì)胞后用30.0 mmol/L 的D-葡萄糖培養(yǎng)，記為轉(zhuǎn)染si-NC+高糖處理組、轉(zhuǎn)染si-LncRNA NORAD+高糖處理組、轉(zhuǎn)染miR-NC+高糖處理組、轉(zhuǎn)染miR-367-3p+高糖處理組；將anti-miRNC、anti-miR-367-3p 分別與si-LncRNA NORAD 轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞后用30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)，記為轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+si-LncRNA NORAD+高糖處理組、轉(zhuǎn)染anti-miR-367-3p+si-LncRNA NORAD+高糖處理組。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測LncRNA NORAD和miR-367-3p的表達(dá)水平

提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s（40 個循環(huán)）；融解曲線：95℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。反應(yīng)結(jié)束后以βactin 和U6 為內(nèi)參計(jì)算相對表達(dá)量用2-△△Ct法。LncRNA NORAD 上游引物序列：5’-TGATAGGATACATCTTGGACATGGA-3’，下游引物序列：5’-AACCTAATGAACAAGTCCTGACATACA-3’；βactin 上游引物序列：5’-CCTCTCCCAAGTCCACACAG-3’，下游引物序列：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；miR-367-3p 上游引物序列：5’-GGACTGTTGCTAATATGCAACTC-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 上游引物序列：5’-CGGGTTTGTTTTGCATTTCT-3’，下游引物序列：5’-AGTCCCAGCATGAACAGCTT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，煮沸變性，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜用5%脫脂奶粉封閉，然后加入α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1 一抗（1∶800）孵育，然后加入二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，抗體孵育結(jié)束后加入ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯影，成像后檢測蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測TGF-β1、IL-1β水平

收集各組細(xì)胞，離心收集上清；按試劑盒說明書操作，以空白組調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度。繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。

1.6 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建野生型和突變型LncRNA NORAD的熒光素酶載體，將其分別與miR-NC 和miR-367-3p 共轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞中，按說明書檢測熒光素酶活性。將si-NC、si-LncRNA NORAD、pcDNA-NC、pcDNA-LncRNA NORAD 轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞中，按1.3中方法檢測miR-367-3p表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖處理上調(diào)LncRNA NORAD，下調(diào)miR-367-3p的表達(dá)

與空白對照組和滲透壓對照組比較，高糖處理組腎小管上皮細(xì)胞中LncRNA NORAD表達(dá)水平升高，miR-367-3p表達(dá)水平降低（均P＜0.05），見圖1。

圖1 高糖處理上調(diào)LncRNA NORAD，下調(diào)miR-367-3p 的表達(dá)（，n=9）

2.2 低表達(dá)LncRNA NORAD抑制腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎性和纖維化因子表達(dá)

與空白對照組和滲透壓對照組比較，高糖處理組腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1蛋白的表達(dá)水平升高，TGF-β1、IL-1β 水平升高（均P＜0.05）；與轉(zhuǎn)染si-NC+高糖處理組比較，轉(zhuǎn)染si-LncRNA NORAD+高糖處理組腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1 蛋白的表達(dá)水平降低，TGF-β1、IL-1β水平降低（均P＜0.05），見圖2。

圖2 低表達(dá)LncRNA NORAD抑制腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎性和纖維化因子表達(dá)（，n=9）

2.3 miR-367-3p抑制腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎性和纖維化因子表達(dá)

與轉(zhuǎn)染miR-NC+高糖處理組比較，轉(zhuǎn)染miR-367-3p+高糖處理組腎小管上皮細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)水平升高，α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1 蛋白的表達(dá)水平降低，TGF-β1、IL-1β 水平降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-367-3p抑制腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎性和纖維化因子表達(dá)（，n=9）

2.4 LncRNA NORAD 靶向miR-367-3p，調(diào)控miR-367-3p的表達(dá)

Starbase 預(yù)測顯示，LncRNA NORAD 和miR-367-3p 有結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）；miR-367-3p 與LncRNA NORAD 野生型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HK-2 細(xì)胞后雙熒光素酶活性降低，而與LncRNA NORAD 突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后雙熒光素酶活性無顯著變化；抑制LncRNA NORAD 表達(dá)后miR-367-3p 表達(dá)水平升高，過表達(dá)LncRNA NORAD 后miR-367-3p表達(dá)水平降低（均P＜0.05），見圖4。

圖4 LncRNA NORAD靶向調(diào)控miR-367-3p（，n=9）

2.5 低表達(dá)miR-367-3p可以逆轉(zhuǎn)LncRNA NORAD低表達(dá)對腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎性和纖維化因子表達(dá)的抑制作用

與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+si-LncRNA NORAD+高糖處理組比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-367-3p+si-LncRNA NORAD+高糖處理組腎小管上皮細(xì)胞中miR-367-3p 表達(dá)水平降低，α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1 蛋白的表達(dá)水平升高，TGF-β1、IL-1β水平升高（均P＜0.05），見圖5。

圖5 低表達(dá)miR-367-3p可以逆轉(zhuǎn)LncRNA NORAD低表達(dá)對腎小管上皮細(xì)胞HK-2炎性和纖維化因子表達(dá)的抑制作用

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病重要的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)和腎小球的病理改變及細(xì)胞損傷等多種因素可能共同參與糖尿病腎病的發(fā)病，腎小管間質(zhì)是發(fā)生腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素，腎小管上皮細(xì)胞損傷以及腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因。因此，抑制腎小管損傷及EMT 的發(fā)生對治療腎臟相關(guān)疾病具有重要意義[10-11]。研究報道，lmcRNA NORAD 可調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的EMT 樣表型[12]。NORAD 通過調(diào)節(jié)miR-422a 的表達(dá)可調(diào)控肺癌細(xì)胞的EMT[13]。表明NORAD 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的EMT。然而，NORAD 對腎小管上皮細(xì)胞的EMT 及損傷的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞損傷模型中NORAD 表達(dá)水平升高，說明NORAD 可能與腎小管的損傷有關(guān)。進(jìn)一步抑制NORAD 表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1、TGF-β1的表達(dá)水平降低；α-SMA是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[14]，F(xiàn)n、COL1a1、COL3a1 等均與細(xì)胞纖維化有關(guān)[15-16]；TGF-β1是致纖維化因子，過多的TGF-β1 可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，造成腎間質(zhì)纖維化[17]。說明抑制NORAD表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞EMT 及纖維化；此外，抑制NORAD 表達(dá)還降低了IL-1β 水平；IL-1β 是促炎細(xì)胞因子，其高表達(dá)可導(dǎo)致人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[18]。表明抑制NORAD表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。綜上，抑制NORAD 表達(dá)可抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT、纖維化及炎癥損傷。

為進(jìn)一步研究NORAD影響腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷及EMT的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測NORAD 可能結(jié)合的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NORAD與miR-367 有結(jié)合位點(diǎn)。研究報道，miR-367 可以抑制腦出血小鼠中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。miR-367-3p與缺血性中風(fēng)相關(guān)的神經(jīng)炎癥相關(guān)[20]。miR-367-3p 還可抑制TGF-β 誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌EMT[21]。說明miR-367 可抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的EMT。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中miR-367-3p 低表達(dá)，提示miR-367 可能參與腎小管上皮細(xì)胞的損傷的過程。過表達(dá)miR-367-3p降低了高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中α-SMA、Fn、COL1a1、COL3a1及TGF-β1、IL-1β表達(dá)；表明過表達(dá)miR-367-3p 抑制了高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥及纖維化。表明NORAD 可靶向調(diào)控miR-367-3p，且低表達(dá)miR-367-3p 可以逆轉(zhuǎn)NORAD低表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性和纖維化的作用。表明NORAD 可能通過調(diào)控miR-367-3p 影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性和纖維化。

綜上所述，LncRNA NORAD 在高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)；抑制LncRNA NORAD表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞的炎癥和纖維化，其分子機(jī)制可能與上調(diào)miR-367-3p表達(dá)有關(guān)。