平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究*

樸明姬，杜金柱，王興陽，尹寶亮，于王子，許 斌

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科，沈陽 110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，沈陽 110000）

乳腺癌作為女性最常見的癌癥，其發(fā)病率和死亡率居高不下[1-2]。目前乳腺癌的治療主要以手術(shù)、化療和放療等方式為主[3]。雖然這些醫(yī)療手段對乳腺癌患者的預(yù)后具有一定的改善作用，但部分患者對化療產(chǎn)生耐藥影響患者的預(yù)后，所以，尋求新的藥物已成為治療乳腺癌的關(guān)鍵。紫杉醇作為一種常用的化療藥物，可以輔助乳腺癌的治療[4-5]，但其耐藥性也較為棘手，因此，提高乳腺癌對于紫杉醇化療藥物的敏感性對于改善治療乳腺癌患者預(yù)后至關(guān)重要。平消膠囊主要包含郁金、仙鶴草、五靈脂、白礬、硝石、干膝（制）、積殼（麩炒）、馬錢子粉等成分。研究表明，平消膠囊對乳腺炎、乳腺增生、乳腺癌等乳腺疾病均有良好的治療效果[6-7]。臨床研究表明，平消膠囊聯(lián)合卡培他濱片治療后，疾病控制率比單純的卡培他濱片治療乳腺癌高出22.44%[8]。平消膠囊聯(lián)合紫杉醇是否可以顯著提高對乳腺癌的治療效果尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探討平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞作用機(jī)制，以期為乳腺癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級健康SD 大鼠(許可證號：SYXK 2019-0108) 6 只（雌雄各3 只），5 周齡，體重130～150 g，購自勁牌有限公司；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)同意且本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）-3R原則。

1.2 藥物與試劑 平消膠囊（國藥準(zhǔn)字號：Z61021330）購自西安正大制藥有限公司；紫杉醇（貨號：33069-62-4）購自蓋德化工網(wǎng)；MCF-7細(xì)胞株購自上海博谷生物科技公司；四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazo-lium，MTT；貨號：13183-79-4）購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；Sigma-Aldlrich 公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI；貨號：25535-16-4)購自上海源葉生物；DMEM培養(yǎng)液（貨號：D6046）購自Worldrm生物商城；RPMI-1640 培養(yǎng)基（貨號：BC-B-021）；胎牛血清(貨號：JLAQ-110)鄭州九龍生物；青霉素（貨號：BC-CE-012）購自南京生航生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（貨號：151874MSDS）購自默克；胰酶（貨號：8049-47-6）購自ChemicalBook 公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒（貨號：PRTD1)購自Cyanagen Srl公司；P21抗體（貨號：64016）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GADPH；貨號：51332）、AMPKα 抗體（貨號：2532）和Caspase-3 抗體(貨號：9662）均購自CST 公司。Bax（貨號：sc-7480）和Bcl-2（貨號：sc-7382）抗體，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自Santa Cruz 公司；T-AOC 試劑盒（貨號：E-BC-K225-M）購自Elabscience 公司；PBS 溶液(貨號：D8537）購自美國Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-GFP/PI 雙染試劑盒（貨號：FY600016-20T）購自弗元生物科技有限公司。

1.3 儀器 Being BPN-RHP CO2培養(yǎng)箱購自集思儀器；EPS-300電泳儀購自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；JS-680D 凝膠成像儀購自杭州得聚儀器設(shè)備公司；1703940 半干電轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；BDF-25V270 低溫冰箱購自博科公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；MH-2 型微型振蕩儀購自北京銘成基業(yè)科技有限公司；SAF-680T酶標(biāo)儀購自上海巴玖公司。

1.4 大鼠分組及平消膠囊血清的制備 將常規(guī)喂養(yǎng)1 周后的6 只大鼠分為平消膠囊組和對照組，每組3 只。平消膠囊組大鼠將1.656 g 的平消膠囊溶解到3 mL的生理鹽水中灌胃，對照組則每日灌胃等體積的生理鹽水，持續(xù)一周。最后一天灌胃后1 h，采用乙醚麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈中采血，然后進(jìn)行離心操作（3 000 r/min，0.5 h），對血清滅活處理（56 ℃，0.5 h），然后通過0.22 mm 微孔濾膜過濾除菌，過濾后采用完全培養(yǎng)液將各組血清配制成10%的血清培養(yǎng)液，放入低溫冰箱保存以備用[9]。將細(xì)胞分為對照組、含藥血清組、紫杉醇組及聯(lián)合組，各組處理如下：對照組采用10%無藥血清培養(yǎng)，含藥血清組采用經(jīng)平消膠囊含藥血清（10%含藥血清）培養(yǎng)，紫杉醇組采用10 μg/mL 紫杉醇血清培養(yǎng)，聯(lián)合組采用經(jīng)平消膠囊含藥血清（10%含藥血清）+10 μg/mL紫杉醇血清培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)在PMI-1640 培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清以及100 U/mL的青霉素。細(xì)胞在37 ℃，5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到75%以上時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT 檢測細(xì)胞抑制情況 收集對數(shù)期的MCF-7 細(xì)胞，接種于96 孔板上，使細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，培養(yǎng)1天后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入各藥物處理，分別向各孔加入100 mL 對應(yīng)的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。接種結(jié)束后在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h，去除上清液，用培養(yǎng)液沖洗3 次以去掉藥液。然后加入50 mL(1 mg/mL)的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，再加入二甲基亞砜(150 mL/孔)使沉淀溶解，然后用微型振蕩儀振蕩12 min，在490 nm 波長下，通過酶標(biāo)儀測出每孔吸光度(opticaldensity，OD)值，取3 孔計(jì)算平均OD 值。將不加任何細(xì)胞的一孔作為空白，無藥血清作為對照組，從而計(jì)算出細(xì)胞生長抑制率%，計(jì)算公式如下：生長抑制率（%）=(1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值)×100%。

1.7 細(xì)胞流式術(shù) 采用胰酶將對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行消化以調(diào)整其密度，然后將MCF-7 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞板中（4×103個(gè)／每孔）。按照實(shí)驗(yàn)分組加入各藥物處理，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，消化細(xì)胞后加入100 mL 二甲基亞砜、20 μL AnnexinV-FITC 及和20 mL PI 染液，混勻后于37 ℃下避光反應(yīng)20 min，在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞的凋亡情況。在消化后細(xì)胞內(nèi)加入70%乙醇溶液固定1 h，PBS 溶液清洗細(xì)胞后加入PI 進(jìn)行染色重懸，置于流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞周期變化。

1.8 蛋白印跡法（Western blotting）檢測測Bax、Bcl-2、Caspase-3、AMPK 和P21 蛋白的表達(dá)量 取對數(shù)生長期MCF-7 細(xì)胞，進(jìn)行消化使其密度為1×105/mL，然后通過6孔板進(jìn)行接種。按照實(shí)驗(yàn)分組加入各藥物處理，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，用3 mL預(yù)冷PBS洗滌3次，然后在SDS樣品緩沖液中煮沸。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，半干法轉(zhuǎn)到PVDF 膜，然后用5%脫脂奶粉，在37 ℃搖床中封閉1 h。將膜與LC3-I/II、BECN1、Bax和Bcl-2（1∶1 000）的一抗在4 ℃下過夜。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗，加入二抗在37°C環(huán)境中培養(yǎng)1 h，顯色成像并通過Image-ProPlus軟件對圖片條帶進(jìn)行灰度值分析，以GADPH（1∶1 000）作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各蛋白的相對水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇抑制乳腺癌細(xì)胞的抑制情況 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，細(xì)胞的抑制率逐漸增大。同一時(shí)間點(diǎn)，與對照組相比，含藥血清組、紫杉醇組和聯(lián)合組中MCF-7細(xì)胞抑制率均升高；與含藥血清組和紫杉醇組比較，聯(lián)合組對細(xì)胞的抑制率更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細(xì)胞抑制效果

2.2 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞的凋亡及周期的影響 與對照組相比，含藥血清組、紫杉醇組和聯(lián)合醇組均可有效的促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，致使細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯，S 期和G2 期比例下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與含藥血清組相比，聯(lián)合組效果更顯著（P＜0.05），見表1、圖2。

圖2 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

表1 各組細(xì)胞凋亡和周期情況 ，%，n=3

表1 各組細(xì)胞凋亡和周期情況 ，%，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與含藥血清組相比，#P＜0.05；與紫杉醇組相比，&P＜0.05。

2.3 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對MCF-7 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，含藥血清組、紫杉醇組和聯(lián)合組中的Bax和Caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 的蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 各組凋亡蛋白表達(dá)比較 ，n=3

表2 各組凋亡蛋白表達(dá)比較 ，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與含藥血清組相比，#P＜0.05；與紫杉醇組相比，&P＜0.05。

圖3 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對MCF-7 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.4 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對AMPK 信號通路的影響 蛋白印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，含藥血清組、紫杉醇組和聯(lián)合組中AMPKα 和P21蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05），聯(lián)合組的作用較單獨(dú)使用時(shí)增強(qiáng)（P＜0.05），見圖4，表3。

表3 各組通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果比較 ，n=3

表3 各組通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果比較 ，n=3

與對照組相比，*P＜0.05；與含藥血清組相比，#P＜0.05；與紫杉醇組相比，&P＜0.05。

圖4 平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇對MCF-7 細(xì)胞通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討論

乳腺癌是最常見的3 種癌癥之一，同時(shí)也是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生難題之一[10-11]。目前對于平消膠囊聯(lián)合紫杉醇是否可以顯著提高對乳腺癌的治療效果尚未見相關(guān)報(bào)道。癌細(xì)胞增殖是腫瘤惡化的特征，在本研究中，通過MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇較單獨(dú)使用后，對MCF-7細(xì)胞抑制率顯著升高，這一結(jié)果說明平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇組更有效地抑制了乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖。有關(guān)研究表明，平消膠囊對多種癌細(xì)胞具有抑制作用，包括乳腺癌等[12]。程實(shí)等[13]報(bào)道鹽酸小檗堿和紫杉醇聯(lián)合對乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。李芳芳等[14]通過構(gòu)建皮下異體移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)平消膠囊聯(lián)合紫杉醇可以抑制小鼠黑色素瘤的生長，本研究結(jié)果與這些研究的結(jié)果相一致。

凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，與癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[15]。已有相關(guān)研究表明平消膠囊可促進(jìn)乳腺癌癌細(xì)胞凋亡[12]。閆順朝等[16]通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)紫杉醇乳腺癌細(xì)胞的凋亡具有誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，平消膠囊含藥血清聯(lián)用紫杉醇較兩者單獨(dú)使用顯著升高了乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的凋亡率。Bax、caspase 3、Bcl-2作為經(jīng)典的凋亡蛋白，其中Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡，Bax 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)，二者可結(jié)合成異質(zhì)二聚體而失活，而當(dāng)二者的相對表達(dá)量失衡時(shí)，可破壞線粒體膜的完整性，最終激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡進(jìn)程的改變[17-19]。Go/G1期為分裂期的準(zhǔn)備階段，Go/G1期細(xì)胞比例下降導(dǎo)致進(jìn)入分裂期的細(xì)胞下降，從而進(jìn)入S期和G2/M期細(xì)胞的數(shù)量也會下降，MCF-7細(xì)胞發(fā)生周期延長或阻滯，使得DNA 合成受阻，抑制細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在凋亡相關(guān)蛋白檢測實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)平消膠囊含藥血清和紫杉醇單獨(dú)使用時(shí)均可上調(diào)Bax 和Caspase-3 蛋白水平，下調(diào)Bcl-2的蛋白水平，且聯(lián)合使用后效果更顯著。這些論據(jù)說明平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇能使促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)凋亡終末效應(yīng)因子Caspase-3 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。失控性生長是腫瘤惡化的特征，主要是因?yàn)榧?xì)胞周期發(fā)生紊亂。本研究經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇后更有效地促進(jìn)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1 期阻滯，使細(xì)胞合成DNA 受阻，導(dǎo)致細(xì)胞分裂受到抑制，說明平消膠囊聯(lián)合紫杉醇可使周期延長或阻滯，抑制細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

AMPK 信號通路在調(diào)節(jié)生長和代謝中發(fā)揮著重要作用，與癌癥的發(fā)病機(jī)制有著較為緊密的關(guān)系[20]。近幾年，有研究報(bào)道AMPK 信號通路參與癌細(xì)胞的增殖與凋亡過程[21-23]。有證據(jù)顯示，當(dāng)AMPK 信號通路被激活時(shí)，會激活P21途徑，從而使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯[24]。本研究結(jié)果顯示，平消膠囊含藥血清聯(lián)用紫杉醇較兩者單獨(dú)使用時(shí)，更顯著地促進(jìn)了AMPKα 和P21 蛋白的表達(dá)。這一結(jié)果說明平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇可通過激活A(yù)MPK，激活P21途徑，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制MCF-7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。梁君偉等[25]報(bào)道二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇可以通過激活A(yù)MPK信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。所以，推斷在本研究中，平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇促進(jìn)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的凋亡可能也是通過這一機(jī)制。關(guān)于消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇在乳腺癌中的療效以及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索與證實(shí)。

綜上所述，平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇可能通過激活A(yù)MPK 信號，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，為今后平消膠囊含藥血清聯(lián)合紫杉醇應(yīng)用于臨床治療乳腺癌提供了理論依據(jù)。