癌痛消方對肝癌大鼠癌痛的調控作用機制研究*

劉 軍，杜寶昌，郭 茜，肖芳芳,武振明,齊秀恒

（河北中石油中心醫院腫瘤科，廊坊 065000）

臨床中晚期癌癥患者最常見的癥狀之一為癌痛，超過半數的癌癥患者存在無法忍受和控制的劇烈疼痛，雖然嗎啡等阿片類藥物能夠有效緩解癌痛，但是長期使用阿片類藥物可能會出現胃腸道反應和伴隨成癮性等副作用，因此如何緩解疼痛成為了臨床研究的一個難題[1-2]。癌痛為與神經病理性疼痛機制和炎癥痛相關的慢性疼痛，因此對其展開研究以適當的動物模型入手是十分合適的。癌痛消方是以傳統的“膈下逐瘀湯”為基礎，加用半枝蓮、元胡、白花蛇舌草、絞股藍、黃芪、莪術、三棱等藥物制備而來，可化瘀解散、清熱解毒、行氣止痛、健脾益氣，且經濟實惠，便于攜帶和使用[3-4]。抑制NF-kB蛋白的表達能夠緩解神經損傷所致的疼痛和炎癥反應，這在既往研究中已有報道，有學者指出NF-kB 蛋白能夠減少癌痛大鼠的痛覺過敏，抑制脊髓小膠質細胞激活[5]。而在已經發現的TLRs 中，TLR2和TLR4所識別的配體最多，不僅能夠與相關配體結合，還能夠與負責特異區別配體的內源性巨噬細胞蛋白結合，增加配體結合靶位，介導和活化相關因子，介導疼痛通路。SIGIRR 蛋白激活可對TLR4-NF-kB 轉導信負調控，進而調節該信號通路終端NF-kB水平，緩解鎮痛。因此，本研究選取NFkB、SIGIRR、TLR2、TLR4 作為檢測指標，就癌痛消方對大鼠癌痛的調控作用機制進行了研究，以期為今后臨床干預提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用肝臟左葉表面注射walker256 細胞成功構造原發性肝癌SD 大鼠模型。SD 大鼠雌雄各半，均為4～5 周齡，體質量為13～17 g，平均（15.72±1.21）g。所有大鼠均購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號：SYXK（京）2020-1134。所有大鼠均標準飼養，設置溫度（21±2）℃，濕度為40%～60%，每12 h光暗交替，每5 min換氣通風1次。

1.2 藥品、主要試劑及儀器

超凈工作臺（上海凈化設備廠產品），TGL-16M臺式高速冷凍離心機（濟南博鑫生物技術有限公司），負80度超低溫冰箱（北京天地精儀科技有限公司），半自動石錯切片機（leikacm3050s 德國），包埋機（LS-100+沈陽市龍首電子儀器有限公司），高速冷凍離心機（GL21M 上虞市博盛生物科技有限公司），普通光學顯微鏡（SZ51奧林巴斯日本），日立全自動生化分析儀（LABOSPECT008日本）。

NF-kB 蛋白、SIGIRR 蛋白、TLR2、TLR4mRNA試劑盒由武漢博士得生物公司購入；鼠兔通用一抗試劑盒、二抗試劑盒、二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒、無水乙醇、甘氨酸、冰乙酸、甲醇、10 μl/200 μl/1 000 μl 進口吸頭AXYGEN、離心管（盒）、PCR管盒、乳膠手套、PE手套，一次性滴管、燒杯均由南寧市博仁實驗用品經營部購入。

1.3 動物分組及造模

參照文獻[6]的方法進行造模，造模前大鼠禁食禁水12 h，依據2.3 mg/kg 的劑量給予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，成功麻醉后取仰臥位，使用橡皮筋將四肢和上肢固定在實驗手術板上。采用沐浴露混合液潤濕皮毛，將部分體毛使用剃須刀刮取，暴露腹部，對手術區域進行常規消毒，將腹部正中線0.5右側旁逐層剪開2 cm，暴露腹腔，將肝左外葉托出，注射walker256 細胞懸液，注射后觀察若無活動性出血則輕送肝臟還納腹腔，確認無異物殘留后，使用無菌可吸收線逐層縫合關腹。

采用肝臟左葉表面注射walker256 細胞成功構造60只原發性肝癌SD大鼠模型，分為3組，癌痛消方低劑量組（0.5 g/mL），癌痛消方中劑量組（1g/mL）和癌痛消方高劑量組（2 g/mL），每組20只。并選取20只健康SD大鼠作為對照組（Control組）。Control組每日1次使用2 mL蒸餾水灌胃，劑量組大鼠每日1次給予2 mL濃度為0.5 g/mL、1 g/mL、2 g/mL的癌痛消方灌胃。

1.4 癌痛消方

癌痛消方：30 g 白花蛇舌草，30 g 赤芍藥，20 g黃芪，15 g半枝蓮，12 g絞股藍，10 g延胡索，10 g三棱，10 g香附，10 g莪術，10 g烏藥，10 g甘草，6 g紅花。由廣西中醫藥大學附屬百年樂藥廠制備，每包15 g。

1.5 Western blotting實驗檢測NF-kB、SIGIRR蛋白的表達水平

采用斷頭法處死大鼠，取脊髓L4～L6 段稱重，并加入80 g/L的裂解液，使用液氮研磨，加入PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解。使用勻漿機勻漿20 s，靜置30 min，以12 000 r/min 的速率離心20 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），取上清液，加入EP管內，-20 ℃保存待測。采用Western blotting 印跡法對NF-kB、SIGIRR蛋白表達進行檢測。

1.6 RT-PCT 實驗檢測TLR2、TLR4 mRNA 的表達量

采用斷頭法處死大鼠，取0.1 g脊髓L4～L6段，加入1 mL 的Trizol Reagent，采用電動勻漿機高速低溫勻漿20 s，靜置后，于1 mL的Trizol試劑內加入0.2 mL的氯仿，劇烈振蕩搖勻后，室溫下靜置2 min，以12 000 r/min的速率離心15 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），取400 μL 移至EP 管內，加入等體積異丙醇，搖勻冰浴15 min，以12 000 r/min的速率離心10 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），棄上清液，倒置在消毒濾紙上，將異丙醇吸干，使用75%乙醇洗滌沉淀，以 7 500 r/min的速率離心5 min（半徑15 cm，溫度4 ℃），棄上清液，風干5 min 后溶于DEPC 水備用。使用RT-PCT 半定量檢測TLR2 和TLR4 mRNA 表達情況。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況

取1 000 mg 新鮮癌灶組織，置于平皿內，加少量PBS，剪為勻漿，加少量PBS，使用吸管吸取勻漿，以尼龍網（100 目）過濾，以1 500 r/min 的速率離心3 min（半徑10 cm），PBS洗3次，以500 r/min的速率離心3 min（半徑10 cm），去除細胞碎片，以尼龍網（300目）過濾細胞團塊，分置兩管內，調整細胞濃度為1×106/mL，置于4 ℃冰箱內保存待測。采用Annexin V/PI 雙染色法染色細胞，用上流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析，計算細胞周期和凋亡率。

1.8 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，兩組均數比較采用t檢驗，多重比較采用dunnett’st檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時刻的NF-kB、SIGIRR 蛋白表達水平比較

Western blotting 實驗結果顯示，不同時刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組NF-kB 蛋白的表達水平均低于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，NF-kB 蛋白的表達水平越低，見圖1A；不同時刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組SIGIRR蛋白的表達水平均高于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，SIGIRR 蛋白的表達水平越高，見圖1B。

圖1 各組大鼠不同時刻的NF-kB和SIGIRR蛋白表達水平比較

2.2 各組大鼠不同時刻的TLR2、TLR4 mRNA表達水平比較

RT-PCT 實驗結果顯示，不同時刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組TLR2、TLR4mRNA 的表達水平均低于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，TLR2、TLR4 mRNA的表達水平越低，見圖2。

圖2 各組大鼠不同時刻的TLR2和TLR4 mRNA表達水平比較

2.3 各組大鼠不同時刻的細胞周期比較

流式細胞儀檢測結果顯示，不同時刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組G0/G1 期細胞比例均高于Control 組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，G0/G1期細胞比例越高，見圖3A；但S期、G2期細胞比例均低于Control組（P＜0.05），癌痛消方的濃度越大，S期、G2期細胞比例越低，見圖3B-C。

圖3 各組大鼠不同時刻的細胞周期比較

2.4 各組大鼠不同時刻的細胞凋亡率比較

流式細胞儀檢測結果顯示，不同時刻（5 d、10 d、15 d）不同濃度（0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL）組細胞凋亡率均高于對照組（P＜0.05），且癌痛消方的濃度越大，細胞凋亡率越高，見圖4。

表4 各組大鼠不同時刻的細胞凋亡率比較

3 討論

癌癥患者病情進展中最常見的癥狀之一為癌性疼痛，簡稱癌痛，癌痛為癌癥患者普遍存在的癥狀，部分患者為間斷性疼痛，多數患者為持續性疼痛，且持續時間長達每日12 h以上，約2/3的癌痛患者為內臟痛，近一半的患者為混合型疼痛，新發癌癥患者癌痛發生率約25%，晚期和復診患者則可高達80%[7]。雖然臨床中對于癌痛的護理和治療在逐步完善，但仍有50%～80%的癌痛患者無法得到晚期緩解，對患者的心理狀況常有嚴重影響，影響治療依從性和臨床療效[8]。

目前臨床上癌痛的藥物治療以“非甾體類”和”阿片類”藥物及神經阻滯鎮痛治療等方法為主[9-10]。且在既往對癌癥患者的研究中可發現，隨著癌細胞活化，各類致炎細胞因子釋放量增加，有學者指出致炎細胞因子在癌痛的發展中也有重要作用[11]。本研究中發現癌痛消方可通過抑制SIGIRR 進而對TLR-NF-kB 途徑產生抑制作用，降低了NF-kB、TLR2和TLR4的表達，進而激活轉錄因子NF-kB的轉錄，以達到抑制趨化因子、致炎因子、細胞因子等多種炎癥介質釋放的效果，而炎癥因子會影響和放大脊髓對傷害性刺激的感受，造成痛覺過敏，誘發患者出現癌痛癥狀，因此NF-kB、TLR2 和TLR4 表達的降低，說明癌痛消方可通過改善炎癥反應，緩解癌痛。提示癌痛消方能夠抑制急性期蛋白的產生，抑制B 細胞和T 細胞的分化，影響適應性免疫，減少巨噬細胞急性期蛋白的產生，抑制局部炎癥反應，激活內皮細胞，減少各類因子與神經元上相應受體的結合，抑制神經元的激活，進而緩解外周神經的痛覺敏化[12]。同時，本研究結果顯示，癌痛消方可使癌細胞停留于細胞周期的G0/G1期，阻止其進入S 期，抑制和阻斷脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）的合成，達到促進凋亡的目的，緩解癌痛的發生。

分析本文結果產生的原因，主要是由于使用率癌痛消方，方中白花蛇舌草歸胃、大腸、肝、小腸經，可消散癰腫、清熱解毒、利濕通淋，主治內癰腹痛、瘡瘍腫毒等[13]；黨參性甘平，可補中益氣、養血生津，是臨床常用的治療脾肺氣虛之證的藥物[14]；半枝蓮味辛苦，性寒，可清熱解毒、活血化瘀、利水消腫，可治熱毒瘡癰、大腹水腫等[15]；莪術味辛散苦泄，性溫通，可破血行氣、消積止痛，三棱味苦辛，性平，破血之力強，二者常用于治療血瘀氣滯或癥瘕積聚所致腹痛、腹脹[16-17]；絞股藍味苦甘性寒，可健脾益氣、理氣除濕、活血生津、清熱解毒，主治脾虛痰濁阻絡熱毒之證[18]；赤芍味苦性寒，可清熱解毒、祛瘀止痛、清瀉肝火，主治癥瘕積聚、血熱之斑疹[19]；延胡索味辛散苦泄，性溫通，可活血行氣止痛，能治血瘀氣滯諸痛[20]；烏藥味辛性溫通，可疏離胸腹之氣，主治寒凝氣滯、陽虛腹痛之證[21]；黃芪味甘性溫，可升舉陽氣、補益脾肺之氣[22]；香附味辛甘微苦，性平，可疏肝理氣、調和氣血、調經止痛，主治肝郁氣滯諸痛[23]；枳實味辛苦，性微寒，可補中益氣、行滯降泄，可治食積氣滯，脘腹痞滿證；甘草味甘性平，可補脾潤肺、解毒緩急[24]。因此，癌痛消方全方配伍精當，組方嚴謹，可健脾益氣、抗癌解毒、化瘀散結，可通過抑制可能與TLR-NF-kB 通道，促進肝癌細胞的凋亡，抑制炎癥反應，發揮較佳的癌痛控制效果[25]。

綜上所述，癌痛消方能夠促使肝癌細胞凋亡，降低炎癥介質釋放，控制癌痛，且以中、高劑量作用明顯，隨著用藥時間的延長，療效也有一定增強，其機理可能與TLR-NF-kB通道的抑制有關。