黃精生品及不同炮制品對糖皮質激素致腎陰虛模型大鼠的作用比較

余歡迎，高海燕，金傳山，張亞中，王桐生，張 偉，許鳳清，柳春風

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；4.金寨潤元生物科技有限公司，安徽 六安 237300)

黃精味甘平，歸脾、肺、腎經，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎的功效，臨床常用于治療腎精虧虛、腰膝酸軟、內熱消渴等證。傳統炮制理論認為，黃精炮制是為去除麻舌的口感和達到防止朽壞的目的，從而達到“滋陰補益”的作用。《醫林篡要·藥性》也有記載“生黃精，實有辛薟之味，戟人喉吻，惟蒸曬久，庶幾補養滋腎耳”，表明黃精經反復蒸曬后可增強滋陰益腎的功效。近年來關于黃精多糖類成分的藥理作用研究較多，但對于黃精炮制前后的滋陰益腎作用比較研究鮮有報道。

現行《中華人民共和國藥典》對酒黃精炮制工藝的描述過于籠統，缺乏具體的工藝參數，難以保證酒黃精飲片的規范性與安全性。劉玲通過析因和正交試驗，優選出酒黃精最佳炮制工藝為蒸制4次，每次蒸制3 h，悶潤3 h。課題組前期研究也發現，黃精在蒸至四蒸時已符合《中華人民共和國藥典》的質量要求，且多糖含量趨于穩定，利于人體吸收的小分子糖類總量也達到峰值，可能成為黃精炮制的拐點和終點。故本實驗擬以多花黃精生品、兩蒸、四蒸及九蒸樣品為研究對象，通過建立糖皮質激素致腎陰虛大鼠模型，比較生品及不同蒸、烘次數酒制品發揮傳統滋陰益腎功效的差異，為酒黃精炮制工藝的優選及臨床的合理應用提供一定的參考依據。

1 材料

1.1 動物 70只SD健康雄性大鼠，(200±20)g，SPF級，購自邳州市東方養殖有限公司[生產許可證號：SCXK(蘇)2017-0003]，動物質量合格證號：202107583。動物福利和實驗過程均遵循安徽中醫藥大學動物實驗研究中心倫理委員會規定。

1.2 藥物與試劑 黃精購自安徽省金寨縣森灃農業科技有限公司，經安徽中醫藥大學劉守金教授鑒定為多花黃精

Polygonatum

cyrtonema

Hua的干燥根莖。氫化可的松注射液(批號20201101)：山西省芮城科龍獸藥有限公司；六味地黃丸(批號210130)：仲景宛西制藥股份有限公司；黃酒：安徽省海神黃酒集團有限公司；環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)試劑盒(批號 20210501-30440A)、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)試劑盒(批號 20210501-30439A)、皮質酮(corticosterone，CORT)試劑盒(批號 20210501-30679C)：泉州睿信生物科技有限公司；肌酐(creatinine，Cr)測定試劑盒(批號 20210415-C011-2-1)：南京建成生物科技有限公司。

1.3 儀器 TGL16M臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；RT-6100型酶標儀：深圳雷杜生命科學股份有限公司；HT-111B型恒溫搖床：上海赫田科學儀器有限公司；RM2016型病理切片機：上海徠卡儀器有限公司；Nikon Eclipse E100型正置光學顯微鏡：日本尼康公司。

2 方法

2.1 黃精樣品制備

2.1.1 生黃精 除去雜質，洗凈，略潤，切厚片，干燥。

2.1.2 酒黃精 取凈制后的生黃精適量，洗凈，用黃酒拌勻(每100 kg黃精加黃酒20 kg)，悶潤至吸盡，放蒸箱內隔水蒸3 h，取出60 ℃恒溫干燥3 h。如此重復操作2、4、9次，得兩蒸、四蒸、九蒸樣品，切厚片，干燥。

2.2 藥液制備 黃精生品及不同炮制品水煎液的制備：取一定量黃精不同炮制品飲片，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮兩次，每次1 h，濾過，合并2次濾液，濃縮，得樣品水煎液(含生藥0.54 g/mL)。六味地黃丸溶液制備：取適量六味地黃丸，加入50 mL蒸餾水制成混懸液(含生藥0.324 g/mL)，現配現用。

2.3 分組給藥及模型復制 70只SPF級雄性SD大鼠，適應性飼養7 d后，隨機分成空白組、模型組、陽性藥組(六味地黃丸組)、生品組(黃精生品組)、兩蒸組(黃精兩蒸組)、四蒸組(黃精四蒸組)、九蒸組(黃精九蒸組)。腎陰虛證大鼠模型的制備方法參照文獻[10]，各給藥組大鼠每日上午灌胃給藥1次，連續11 d，給藥容積為10 mL/kg，空白組及模型組給予等量蒸餾水。于實驗的第8—11天下午，除空白組外其余各組均灌胃氫化可的松注射液(50 mg/kg)，空白組灌胃等量蒸餾水。第12天，將大鼠全部麻醉后進行腹主動脈取血，采血完成后，迅速分離大鼠兩側腎上腺組織。黃精的藥典推薦劑量為15 g/d，六味地黃丸的給藥劑量為9 g/d，按照體表面積法計算等效劑量，給藥劑量為4倍等效劑量，即黃精各樣品給藥劑量為5.4 g/kg，六味地黃丸給藥劑量為3.24 g/kg。

2.4 一般狀況觀察 于給藥及模型復制過程中觀察大鼠的精神狀態、毛色、活動量及大小便等一般情況的變化。

2.5 體質量、體溫測定 于實驗第7天(模型復制前)、第11天(末次給藥后)測定大鼠體質量、體溫，并記錄。

2.6 血液指標測定 末次模型復制后大鼠禁食不禁水12 h，于第12天腹主動脈取血。將取好的血液放置30 min，以3 000 r/min離心15 min，將分離出的血清和血漿分裝凍存，待測。嚴格按照試劑盒測定方法進行實驗，檢測大鼠血漿中cAMP、cGMP含量以及血清中CORT、Cr含量。

2.7 大鼠腎上腺病理觀察 將各組大鼠腎上腺組織用4%甲醛固定，經過常規石蠟包埋、切片與貼片后，用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，于光學顯微鏡下觀察腎上腺組織的病理學變化。

3 結果

3.1 一般狀況 在預防性給藥1周的過程中，各組大鼠精神狀態正常，行動敏捷，體質量增長平穩。在灌胃氫化可的松2 d后，模型組大鼠體質量下降明顯，出現體溫升高、煩躁不安、豎毛、拱背、毛色無華、尿量增加、小便色黃、大便干結色黑等腎陰虛的癥狀。各給藥組上述癥狀較模型組均有一定程度改善。模型復制過程中模型組和生品組大鼠各死亡1只。

3.2 各組大鼠體質量、體溫比較 與空白組比較，模型組大鼠的體質量顯著減少、體溫顯著升高(

P

<0

.

05)。與模型組比較，兩蒸組、四蒸組大鼠體質量顯著增加(

P

<0

.

05)，陽性藥組、生品組及兩蒸組大鼠體溫顯著降低(

P

<0

.

05)。其余各組大鼠體質量、體溫的改善不明顯(

P

>0

.

05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量及體溫比較

3.3 各組大鼠血漿cAMP、cGMP水平及其比值比較 與空白組比較，模型組大鼠血漿cGMP的水平顯著降低(

P

<0

.

05)，cAMP水平及cAMP/cAMP比值顯著上升(

P

<0

.

05)。與模型組比較，各給藥組大鼠血漿cAMP的水平均顯著降低(

P

<0

.

05)；除生品組外，其他各給藥組大鼠血漿cGMP的水平顯著升高(

P

<0

.

05)，cAMP/cGMP的比值顯著降低(

P

<0

.

05)。與生品組比較，四蒸組大鼠血漿cGMP水平顯著升高(

P

<0

.

05)。見表2。

表2 各組大鼠血漿cAMP、cGMP水平及其比值比較

3.4 各組大鼠血清CORT及Cr水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清CORT、Cr水平顯著升高(

P

<0

.

05)。與模型組比較，除生品組外，其余各給藥組大鼠血清CORT、Cr水平均顯著降低(

P

<0

.

05)。與生品組比較，四蒸、九蒸組大鼠血清CORT、Cr水平均顯著降低(

P

<0

.

05)。見表3。

表3 各組大鼠血清CORT、Cr水平比較

3.5 各組大鼠腎上腺病理變化情況比較 與空白組比較，模型組腎上腺發生萎縮，球狀帶以及束狀帶的結構不清晰，細胞排列紊亂，較多實質細胞氣球樣變性，細胞腫脹，核居中，胞質空泡化，較多竇狀隙瘀血擴張；陽性藥組球狀帶、束狀帶及網狀帶的結構清晰，細胞排列有序，偶見實質細胞水樣變性，腎上腺組織形態與空白組最為接近；兩蒸組、四蒸組及九蒸組球狀帶、束狀帶及網狀帶的結構尚清晰，細胞排列較整齊，少見實質細胞氣球樣變性，細胞腫脹，胞質空泡化；生品組球狀帶、束狀帶及網狀帶的結構不清晰，細胞排列紊亂，較多實質細胞氣球樣變性，細胞腫脹，核居中，胞質空泡化。觀察結果提示：模型組大鼠腎上腺組織細胞損傷較為明顯，陽性藥組及各黃精炮制品組對受損的腎上腺組織均有一定程度的改善作用，生品組對腎陰虛模型大鼠的腎上腺組織無明顯改善作用。見圖1。

圖1 各組大鼠腎上腺組織病理變化情況比較(HE染色，10×20倍)

4 討論

本研究選用短期大劑量給予糖皮質激素的方法復制腎陰虛證大鼠模型。糖皮質激素類藥物屬于陽剛之品，過量使用，易傷陰，導致腎陰虛。研究發現，灌胃氫化可的松后，大鼠逐漸出現體質量減輕、大便干結、易驚易怒、毛發干枯無光澤等現象，與腎陰虛的臨床癥狀基本一致，表明腎陰虛大鼠模型復制成功。其中，生品、兩蒸組大鼠體溫顯著降低，兩蒸、四蒸組大鼠體質量顯著增加，其余各組不明顯，這可能與炮制過程中藥性的改變有關。古人認為，黃精經反復蒸曬后可以達到轉苦為甘、寒性變平的效果，而黃精生品的偏性可能為其降低大鼠體溫的基礎，隨著炮制過程中偏性被逐漸消除，性味轉為甘、平，繼而發揮補益功效，四蒸組、九蒸組降低體溫的作用也就逐漸減弱。

cAMP和cGMP作為細胞內參與調節物質代謝和生物學功能的重要物質，其作用既相互拮抗，又相互協調維持著整個生命過程。有研究表明，腎陰虛患者表現為血漿cAMP水平升高、cGMP水平降低，同時cAMP與cGMP比值也顯著升高。血清中CORT水平的變化可以反映出腎陰虛證腎上腺皮質功能的狀態，故研究中常用作腎陰虛模型的評價指標之一。此外，有研究發現，腎陰虛證除表現出一般的陰虛癥狀外，還伴隨血清Cr水平的升高。本研究結果表明，不同炮制品能升高大鼠血漿cGMP水平，降低cAMP、cAMP/cGMP比值及血清CORT、Cr水平；生品能降低大鼠血漿cAMP水平。炮制品和生品均能改善腎陰虛大鼠癥狀。其中，炮制品的調節作用顯著優于生品，可能由于黃精經反復蒸曬消除了具有刺激性的黏液質，使其滋而不膩，同時借助黃酒的提升作用，增強其滋陰益腎的作用。陳嘉謨在《本草蒙荃》中提出“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失”，強調了炮制程度對臨床功效的重要性。黃精在炮制過程中多糖類成分會大量水解成利于人體吸收的小分子糖類成分，隨著炮制過程的推進，小分子糖類又會和氨基酸類成分發生美拉德反應，使有效成分損失，這可能是九蒸樣品在改善腎陰虛大鼠藥效相關指標方面稍弱于四蒸樣品的主要原因。四蒸樣品的小分子糖類成分含量高，更易于人體吸收，有利于有效成分的充分發揮，從而增強其補益作用。

本研究發現，黃精不同炮制品均能一定程度改善腎陰虛大鼠癥狀，其作用機制可能與其改善環核苷酸系統、下丘腦-垂體-腎上腺軸激素水平及腎上腺組織的保護作用有關。黃精酒制后滋陰益腎作用增強，臨床在預防及改善腎陰虛相關疾病時推薦使用酒制品。四蒸黃精在改善腎陰虛大鼠環核苷酸系統、下丘腦-垂體-腎上腺軸激素水平及腎上腺組織形態方面稍優于其他炮制品，為課題組前期優選出的酒黃精產業化生產工藝的可行性提供了實驗依據，后續將對黃精發揮滋陰益腎作用的物質基礎進行更深入的研究，以期揭示黃精炮制增效的科學內涵。