LC3、MMP-14及PD-1在喉癌中的表達(dá)及與病理特征和預(yù)后的相關(guān)性*

吳筱蔓 周興星 顧翔 喻慧嶺 潘曉玲 周敏

(華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)，隨著飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)喉癌發(fā)病率及死亡率呈明顯增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者的健康與生命。有學(xué)者報(bào)道，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associatedprotein1 lightchain3，LC3)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因，與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶(Recombinant Matrix Metalloproteinase，MMPs)可降解血管基底膜及其他基質(zhì)成分，加速腫瘤的侵襲，在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中起著重要作用[2]。現(xiàn)有較多學(xué)者報(bào)道，程序性死亡因子1(Mouse Programmed Death 1，PD-1)具有負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的功能，在惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[3-5]。本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LC3、MMP-14及PD-1在喉癌及非喉癌組織中的表達(dá)情況，并分析上述三種蛋白與喉癌患者病理特征的關(guān)系，以探討LC3、MMP-14及PD-1表達(dá)情況對(duì)患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016年7月～2018年7月于我院收治的36例喉癌患者的臨床資料，所有患者均經(jīng)手術(shù)或穿刺活檢證實(shí)，共36份喉癌組織標(biāo)本設(shè)為觀察組。其中男性21例，女性15例；年齡45～78歲，平均年齡(55.59±3.57)歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期21例；吸煙量>400(年×支/日)者20例，吸煙量≤400(年×支/日)者16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、影像檢查確診為喉癌。②預(yù)測(cè)生存期在6個(gè)月以上者。③臨床、影像資料完整。④均選取同一標(biāo)本，分別檢測(cè)LC3、MMP-14及PD-1水平。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤、器官衰竭等嚴(yán)重者。②腫瘤出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。③術(shù)前已進(jìn)行化療或放療治療者。同時(shí)選取上述36例喉癌患者手術(shù)切除的正常組織標(biāo)本作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人多克隆抗體LC3、MMP-14及PD-1均由美國(guó)Santa Cruz公司提供，DNA顯色劑由北京中杉金色橋生物技術(shù)公司提供，抗體免疫組織化學(xué)試劑盒由上海嶸葳達(dá)實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 采用免疫組化SP染色。將喉癌組織和正常組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟切片、脫水，加入100%、95%、85%梯度酒精各5 min，自來(lái)水沖洗。3%過(guò)氧化氫溶液-甲醇室溫10 min，蒸餾水沖洗3 min，pH9.0EDTA緩沖液煮沸20 min抗原修復(fù)，加一抗(1∶70)室溫放置2 h。用DNA顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察LC3、MMP-14及PD-1，檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)完成后由2位高年資醫(yī)師雙盲法閱片。

1.2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞占比：0分(無(wú)陽(yáng)性)、小于30.00%(1分)、大于等于30.00%(2分)。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分(無(wú)色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比小于26%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞壁大于75%為4分。根據(jù)兩者相乘結(jié)果進(jìn)行評(píng)判：小于3分(-)、3分(+)、4分(++)、5分(+++)。陽(yáng)性率=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 LC3、MMP-14及PD-1在不同組織中的表達(dá) 喉癌組織中的LC3、MMP-14及PD-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.11%、72.22%、58.33%；正常組織中的LC3、MMP-14及PD-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.22%、41.67%、8.33%；兩者LC3、MMP-14及PD-1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 LC3、MMP-14及PD-1在不同組織中的表達(dá)[n(×10-2)]

圖1 免疫組化染色(500×)

2.2 喉癌組織中LC3、MMP-14及PD-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 選取有意義的單因素進(jìn)一步行多因素分析，LC3、MMP-14及PD-1表達(dá)情況與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 喉癌組織中LC3、MMP-14及PD-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 36例喉癌患者兩年生存率 本研究以門診復(fù)查或電話隨訪的方式進(jìn)行為期2年的隨訪，截止于2020年7月，36例喉癌患者共死亡10例，存活26例，存活率為72.22%。

2.4 LC3、MMP-14及PD-1表達(dá)與喉癌預(yù)后的關(guān)系 LC3表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存期分別為(28.65±2.49)個(gè)月、(32.92±1.99)個(gè)月，MMP-14表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存期分別為(30.46±1.48)個(gè)月、(24.48±1.79)個(gè)月，PD-1表達(dá)陰性及表達(dá)陽(yáng)性中位生存期分別為(25.71±2.04)個(gè)月、(19.40±1.63)個(gè)月。生存分析顯示LC3表達(dá)陽(yáng)性者生存期較長(zhǎng)，MMP-14及PD-1表達(dá)陰性者生存期較長(zhǎng)，Keplan-meier生存曲線明顯不同(P<0.05)，見(jiàn)圖2～4。

圖2 LC3陽(yáng)性表達(dá)與LC3陰性表達(dá)期比較

2.5 影響喉癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析 年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、吸煙史非影響喉癌患者預(yù)后生存的相關(guān)危險(xiǎn)因素(P>0.05)，臨床分期(Ⅲ～Ⅵ期)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化、LC3表達(dá)陽(yáng)性、MMP-14表達(dá)陽(yáng)性及PD-1表達(dá)陽(yáng)性為影響喉癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖3 MMP-14陽(yáng)性表達(dá)與MMP-14陰性表達(dá)期比較

圖4 PD-1陽(yáng)性表達(dá)與PD-1陰性表達(dá)期比較

表3 影響喉癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析

3 討論

喉癌發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，較多學(xué)者研究認(rèn)為，喉癌的發(fā)生可能與空氣污染、煙酒過(guò)度、職業(yè)性接觸致癌物等因素有關(guān)[6-8]。隨著分子水平的發(fā)展，特別是癌基因?qū)δ[瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究成為臨床醫(yī)師關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來(lái)，有不少學(xué)者報(bào)道，生物學(xué)指標(biāo)對(duì)喉癌的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)有重要意義[9-11]。

自噬是真核細(xì)胞降解蛋白的重要途徑，有助于細(xì)胞成分和細(xì)胞器的正常更新[12]。相關(guān)研究指出，真核細(xì)胞中溶酶體依賴的內(nèi)源性底物均會(huì)經(jīng)過(guò)自噬等自我降解的過(guò)程，影響細(xì)胞清除廢物、生長(zhǎng)發(fā)育、重建結(jié)構(gòu)等過(guò)程，并在這些過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。LC3被鑒定是自噬溶酶體最基本的組成成分，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性成正比，當(dāng)LC3水平降低時(shí)，細(xì)胞自噬能力下降，細(xì)胞惡性增殖速度加快，而變異、損傷的細(xì)胞得不到有效及時(shí)的清除，則會(huì)發(fā)生癌變[14-15]。同時(shí)LC3缺失或下調(diào)，會(huì)激活多種癌基因，誘發(fā)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促使喉部組織惡性病變，加重病情進(jìn)展[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中LC3陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常組織陽(yáng)性表達(dá)率(P<0.05)，與韓冰等[19]研究結(jié)果相符。提示喉癌組織中存在LC3表達(dá)缺失或下調(diào)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自噬能力下降，惡性細(xì)胞快速增殖，導(dǎo)致喉癌發(fā)生。

既往文獻(xiàn)資料報(bào)道，MMP-14是MMPs家族中主要的特殊蛋白酶，可直接降解、破壞腫瘤患者細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，具有促進(jìn)新生血管生成的作用[20-21]。MMP-14可以啟動(dòng)細(xì)胞表面多個(gè)蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接降解與破壞腫瘤患者的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，打破阻擋腫瘤細(xì)胞因子浸潤(rùn)的屏障。PD-1是負(fù)性共刺激信號(hào)之一，在淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中，被誘導(dǎo)表達(dá)的一個(gè)免疫抑制性受體，與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)[22]。既往研究報(bào)道MMP-14、PD-1在惡性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高[23]，與本研究結(jié)果結(jié)論一致。分析MMP-14、PD-1在喉癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較高的原因是MMP-14可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，會(huì)促進(jìn)喉癌細(xì)胞的血管生成，加重癌細(xì)胞侵襲[24]。PD-1與其配體結(jié)合后，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受，可抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞活化，給喉癌細(xì)胞提供了逃避機(jī)體免疫監(jiān)控和殺傷的機(jī)會(huì)，促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[25]。由此可見(jiàn)，二者對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移均發(fā)揮了重要作用。

臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為臨床公認(rèn)的判斷喉癌侵襲程度與預(yù)后的關(guān)鍵性指標(biāo)。本研究中高分化喉癌組織LC3陰性表達(dá)率更低，MMP-14及PD-1陽(yáng)性表達(dá)更高，也表達(dá)腫瘤分化程度與LC3、MMP-14及PD-1表達(dá)密切相關(guān)，這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道相符[26]。已有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)MMP-14、PD-1在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[27]。本研究結(jié)果表明，LC3、MMP-14及PD-1的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P<0.05)。

生存分析顯示，LC3表達(dá)陰性、MMP及PD-1表達(dá)陽(yáng)性者2年內(nèi)平均生存時(shí)間明顯短于與LC3表達(dá)陽(yáng)性、MMP-14及PD-1表達(dá)陰性者(P<0.05)，提示LC3、MMP-14及PD-1與喉癌患者預(yù)后存在密切聯(lián)系。亦說(shuō)明LC3的缺少或下調(diào)影響細(xì)胞凋亡過(guò)程，增加了細(xì)胞突變的幾率，大幅提高了喉癌的發(fā)生率；MMP-14及PD-1高表達(dá)腫瘤的侵襲力，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[28]。但本研究仍存在不足，可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在偏倚，今后我們將改善相關(guān)研究方法，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本范圍，以降低實(shí)驗(yàn)誤差，并對(duì)LC3、MMP-14及PD-1的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

LC3陰性表達(dá)及MMP-14、PD-1陽(yáng)性表達(dá)會(huì)增加喉癌患者死亡率，影響喉癌患者預(yù)后生存率。LC3、MMP-14、PD-1可作為判斷喉癌患者腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的標(biāo)志物，對(duì)評(píng)估患者預(yù)后具有重要意義。