催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定鮮蝦中的微量鉻（Ⅵ）

張小燕，郭楠楠，宋淑亞，張靜林，屈展平，劉德陽(yáng)

（1.洛陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000；2.鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450000）

蝦是一種生活在水中的節(jié)肢動(dòng)物，屬甲殼類，含有豐富的蛋白質(zhì)和鈣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。鉻是一種毒性很大的重金屬元素，具有生物毒性和環(huán)境遷移性，在蝦中容易富集。我國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中鉻含量有明確的限量要求，GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》規(guī)定水產(chǎn)動(dòng)物及其制品鉻含量不得超過(guò)2.0 mg/kg[2]。故對(duì)鮮蝦中有毒有害元素含量的檢測(cè)是非常必要的。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的食品中鉻含量的測(cè)定方法主要有石墨爐原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES）[3-4]。與上述測(cè)定方法相比，催化動(dòng)力學(xué)光度法具有儀器簡(jiǎn)單、測(cè)定費(fèi)用較低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[5]，因此，本試驗(yàn)探討催化動(dòng)力學(xué)光度法對(duì)鮮蝦中鉻含量的測(cè)定條件及動(dòng)力學(xué)條件，建立一種測(cè)定鮮蝦中鉻含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮蝦：市售。

100 μg/mL鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液：北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院；30%過(guò)氧化氫：蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；茜素紅：天津市福晨化學(xué)試劑廠；甲基紅：天津市大茂化學(xué)試劑廠；溴甲酚綠：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；茜素綠：北京百靈威科技有限公司；亮綠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙酸鈉：鄭州世紀(jì)凱美化工產(chǎn)品有限公司；濃硝酸：淮南市友友化工有限公司；冰醋酸：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。以上均為分析純。

1.2 主要儀器

iCAP RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；756PC紫外可見分光光度計(jì)：上海悅豐儀器儀表有限公司；M6微波消解儀：上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；DZKW-D-4恒溫水浴箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

參考朱有濤等[6]方法，采用微波消解的前處理方法來(lái)處理樣品。稱取樣品0.5 g，清洗干凈，向其中添加5.00 mL硝酸、2.00 mL過(guò)氧化氫，放入微波消解儀中，根據(jù)微波消解儀的操作步驟消解試樣（設(shè)置條件為第一步：設(shè)置溫度120℃，升溫時(shí)間5 min，恒溫時(shí)間5 min；第二步：設(shè)置溫度160℃，升溫時(shí)間5 min，恒溫時(shí)間10 min；第三步：設(shè)置溫度180℃，升溫時(shí)間5 min，恒溫時(shí)間10 min）。待消解完成冷卻后，取出消解罐，用少量蒸餾水洗滌消解罐2次～3次，將洗滌液移入50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容備用。

1.3.2 樣品分析方法

取兩支干燥潔凈的25 mL具塞比色管。向標(biāo)有催化體系的比色管中加入1.2 mL的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，非催化體系不加鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再依次加入5.00 mL醋酸-醋酸鈉溶液、0.40 mL溴甲酚綠溶液、0.10 mL過(guò)氧化氫，輕輕晃動(dòng)使其混合均勻，再加入蒸餾水，稀釋至刻度線。60℃恒溫水浴鍋中加熱5 min，取出后立即用流水沖刷外壁降溫到室溫（25℃），備用。以蒸餾水為空白，調(diào)整波長(zhǎng)為610 nm，分別測(cè)定催化和非催化這兩種體系的吸光度A和A0，計(jì)算差值ΔA。

式中：ΔA為吸光度差值；A0為非催化體系吸光度；A為催化體系吸光度。

1.3.3 樣品中鉻含量的測(cè)定

在25 mL比色管中依次加入5.00 mL醋酸-醋酸鈉溶液、0.40 mL溴甲酚綠溶液、0.10 mL過(guò)氧化氫，加水稀釋至刻度，測(cè)定其吸光度記為空白。吸取5.00 mL樣品消化液于25 mL的比色管中，再向比色管中依次加入5.00 mL醋酸-醋酸鈉溶液、0.40 mL溴甲酚綠溶液、0.10 mL過(guò)氧化氫，用蒸餾水稀釋至刻度，輕搖混合均勻，隨后置于60℃的恒溫水浴箱中加熱5 min，水浴加熱完成后，將比色管冷卻至室溫（25℃），測(cè)定其吸光度，樣品中鉻含量按下列公式計(jì)算。

式中：X樣為吸取的試樣中鉻含量，mg/kg；C為試樣中鉻的濃度，μg/mL；V1為所取樣品的體積，mL；V2為消解后樣品的定容體積，mL；m樣為稱取樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 精密度分析

按1.3.3方法，在最優(yōu)條件下，進(jìn)行鉻含量的測(cè)定，做5次平行，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性及檢測(cè)結(jié)果的精密度。

1.3.5 催化動(dòng)力學(xué)光度法與ICP-MS測(cè)定結(jié)果比較

取鮮蝦樣品，在相同的消化條件下，分別使用催化動(dòng)力學(xué)光度法和GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》中的ICP-MS測(cè)定樣品中的微量鉻，各進(jìn)行5次平行測(cè)定，使用t檢驗(yàn)比較兩種方法是否存在顯著性差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS單因素方差分析對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳色素的選擇

色素對(duì)吸光度的影響結(jié)果見表1。

表1 色素對(duì)吸光度的影響Table 1 Effect of pigments on absorbance

在催化動(dòng)力學(xué)光度法中，選擇合適的色素更有利于對(duì)于測(cè)定結(jié)果的判定。由表1可知，在非催化體系中，茜素綠吸光度最大，甲基紅吸光度最小；催化體系中茜素紅的吸光度最大，甲基紅的吸光度最小。色素不同，ΔA不同。色素為茜素紅時(shí)，ΔA最小；色素為溴甲酚綠時(shí)，ΔA最大，ΔA值的大小可直接表征催化效果強(qiáng)弱，因此確定的最佳色素為溴甲酚綠。Cr（Ⅵ）對(duì)溴甲酚綠-H2O2體系的褪色作用催化效果最佳，從而確定Cr（Ⅵ）測(cè)定的最佳反應(yīng)體系為Cr（Ⅵ）-溴甲酚綠-H2O2催化反應(yīng)體系。

2.2 最佳波長(zhǎng)的選擇

波長(zhǎng)對(duì)吸光度影響較大，選取波長(zhǎng)590nm～630nm，考察其對(duì)吸光度的影響，結(jié)果見表2。

表2 波長(zhǎng)對(duì)吸光度的影響Table 2 Effect of wavelength on absorbance

由表2可知，非催化和催化體系在波長(zhǎng)為610 nm～620 nm吸光度較大，偏離此范圍兩體系吸光度均減小。波長(zhǎng)從590 nm到610 nm，ΔA整體呈上升趨勢(shì)；超過(guò)610 nm后呈下降趨勢(shì)，波長(zhǎng)在600 nm～620 nm范圍內(nèi)催化效果較明顯，在610 nm時(shí)，ΔA值最大，說(shuō)明Cr（Ⅵ）對(duì)過(guò)氧化氫氧化溴甲酚綠反應(yīng)在610 nm的催化效果最顯著，因此確定的最適波長(zhǎng)為610 nm。

2.3 最佳pH值的選擇

pH值對(duì)吸光度的影響結(jié)果見表3。

表3 不同pH值對(duì)吸光度的影響Table 3 Effect of pH on absorbance

酸度對(duì)催化反應(yīng)體系影響很大。酸度太大，會(huì)導(dǎo)致溶液反應(yīng)體系不穩(wěn)定；酸度太小，不利于元素測(cè)定。由表3可知，ΔA值隨著pH值增加而變化，pH值在3.2～4.4范圍內(nèi)，ΔA值隨著pH值增加而增加；繼續(xù)增加pH，ΔA值又呈下降趨勢(shì)，pH值為4.4時(shí)，ΔA最大，Cr（Ⅵ）的催化作用最強(qiáng)，因此確定最適pH值為4.4。

2.4 過(guò)氧化氫最佳用量的選擇

過(guò)氧化氫用量對(duì)吸光度的影響結(jié)果見表4。

過(guò)氧化氫作為氧化劑，其用量對(duì)反應(yīng)影響較大。由表4可知，隨著過(guò)氧化氫用量的增大，ΔA先增加隨后下降，過(guò)氧化氫用量在0.10 mL～0.20 mL范圍內(nèi)催化效果較明顯，且當(dāng)過(guò)氧化氫用量為0.10 mL時(shí)，體系ΔA值最大，其用量過(guò)高、過(guò)低時(shí)催化作用均不明顯。因此確定過(guò)氧化氫最佳用量為0.10 mL。

表4 過(guò)氧化氫用量對(duì)吸光度的影響Table 4 Effect of Hydrogen peroxide dosage on absorbance

2.5 溴甲酚綠最佳用量的選擇

溴甲酚綠對(duì)吸光度的影響結(jié)果見表5。

表5 溴甲酚綠用量對(duì)吸光度的影響Table 5 Effect of bromocresol green on absorbance

溴甲酚綠用量直接影響氧化還原作用效果。由表5可知，溴甲酚綠用量對(duì)催化和非催化體系吸光度影響顯著（p<0.05）。隨著溴甲酚綠用量不斷增加，ΔA先增加后減少，溴甲酚綠用量在0.20 mL～0.60 mL催化效果較明顯，0.40 mL時(shí)催化效果最佳，ΔA值最大。可能由于用量過(guò)少時(shí)，氧化反應(yīng)底物較少；用量過(guò)多時(shí)，Cr（Ⅵ）的催化作用相對(duì)較弱。因此選擇溴甲酚綠的最佳用量為0.40 mL。

2.6 最佳反應(yīng)溫度的選擇

反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響結(jié)果見表6。

表6 反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響Table 6 Effect of reaction temperatures on absorbance

由表6可知，反應(yīng)溫度對(duì)非催化和催化體系吸光度影響顯著（p<0.05）。反應(yīng)溫度30℃～50℃時(shí)，Cr（Ⅵ）只起到微弱的催化作用，催化反應(yīng)進(jìn)行相對(duì)緩慢，ΔA值變化不明顯。反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，ΔA達(dá)到最大，催化效果最明顯，之后反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，ΔA有所降低，反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，其ΔA值與其它溫度的ΔA值存在顯著性差異（p<0.05），因此選擇反應(yīng)溫度為60℃。

2.7 最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇

反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響結(jié)果見表7。

表7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響Table 7 Effect of reaction time on absorbance

由表7可知，反應(yīng)時(shí)間由3 min延長(zhǎng)至5 min，ΔA隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；反應(yīng)時(shí)間5 min時(shí)，ΔA最大，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，ΔA甚至出現(xiàn)負(fù)值，說(shuō)明相對(duì)較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，催化效果更佳；反應(yīng)時(shí)間為5min時(shí)，其ΔA值與其它時(shí)間ΔA值之間存在顯著性差異（p<0.05），因此選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.8 工作曲線的確定

在上述確定的最佳反應(yīng)條件下，分別移取濃度為10 μg/mL 的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 加入到反應(yīng)體系，計(jì)算ΔA，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=9.982 2x+0.000 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，方法的準(zhǔn)確度及靈敏性較好，適用于測(cè)定鮮蝦中的微量鉻。

2.9 精密度試驗(yàn)結(jié)果

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，對(duì)鉻含量進(jìn)行5次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別為 0.877、0.905、0.843、0.926、0.930 mg/kg，測(cè)定的平均值為0.896 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.036，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%，說(shuō)明該方法的精密度較高，重現(xiàn)性較好。

2.10 催化動(dòng)力學(xué)光度法與ICP-MS測(cè)定結(jié)果比較

在最優(yōu)條件下對(duì)鉻含量進(jìn)行5次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果分別為 0.877、0.905、0.843、0.926、0.930 mg/kg，測(cè)定的平均值為0.896 mg/kg；ICP-MS法5次平行測(cè)定結(jié)果分別為 0.871、0.922、0.834、0.963、0.932 mg/kg，測(cè)定的平均值為0.904 mg/kg，計(jì)算t值=0.388，根據(jù)自由度為4，查t值表t（4）0.05=2.776，t（4）0.01=4.604，所得t值小于臨界值，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法不存在顯著性差異。

3 討論

近年來(lái)，相關(guān)學(xué)者對(duì)鉻含量的測(cè)定方法進(jìn)行了一些研究，探索出一些食品中鉻元素的檢測(cè)方法，對(duì)有毒有害元素檢測(cè)具有一定的理論指導(dǎo)意義。高向陽(yáng)等[7]通過(guò)微波消解－流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法快速測(cè)定調(diào)味品中的微量鉻，在最佳條件下，鉻濃度線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率高，為微量鉻的測(cè)定提供了一種較為理想的分析方法，有較高的普及推廣和應(yīng)用價(jià)值。昝川南[8]進(jìn)行食用明膠中微量鉻含量測(cè)定的方法研究，結(jié)果表明樣品使用硝酸-雙氧水消解體系進(jìn)行微波密閉消解，并采用原子吸收-石墨爐法測(cè)定食用明膠中微量鉻，靈敏度高、精密度高、回收率高，質(zhì)控樣測(cè)定結(jié)果接近中值，是適合用于明膠中微量鉻測(cè)定的較好的方法。李輝等[9]利用雙波長(zhǎng)雙指示劑催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定市售散裝低價(jià)粉條中鉻含量，方法準(zhǔn)確度好、重現(xiàn)性好。王玉蘭等[10]采用氫化物原子熒光光度法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的鉻、鉛、無(wú)機(jī)砷含量。

目前，催化動(dòng)力學(xué)測(cè)定微量鉻在水處理方面研究較多[11-14]，在食品檢測(cè)中應(yīng)用研究相對(duì)較少[15-17]。催化動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法可作為一種操作簡(jiǎn)單的食品組分定量分析手段。白靜等[18]建立了溴酸鉀-酸性鉻藍(lán)K催化動(dòng)力學(xué)反應(yīng)體系測(cè)定醬油中甲醛含量。趙樺萍等[19]催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定肉制品中亞硝酸鹽含量，精密度高、準(zhǔn)確性好。郭振良等[20]利用催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定奶制品中微量三聚氰胺，操作簡(jiǎn)單、選擇性好。

4 結(jié)論

建立催化動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定微量鉻的Cr（Ⅵ）-H2O2-溴甲酚綠的催化反應(yīng)體系。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳試驗(yàn)條件：在波長(zhǎng)為610nm的條件下，使用5.00mL、pH 4.4的HAc-NaAc緩沖溶液，0.10 mL 3%的過(guò)氧化氫溶液，0.40 mL的溴甲酚綠溶液，隨后在60℃的恒溫水浴鍋中加熱5 min。方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%，精密度良好，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示其與ICP-MS方法相比，不存在顯著性差異。該方法操作簡(jiǎn)便，分析成本低，而且準(zhǔn)確性較高，可以較好用于鮮蝦中微量鉻的測(cè)定。