鐵死亡在哮喘氣道炎癥中的作用及針刺干預研究進展

湯蔚峰，滕方舟，宗雨婷，宋京蓉，秦靜靜，董競成,2，魏穎,2

1. 復旦大學附屬華山醫院中西醫結合科，上海200040；2. 復旦大學中西醫結合研究院，上海200040

支氣管哮喘（哮喘）是一種常見的慢性呼吸道疾病，是世界范圍內嚴重影響人類健康的常見病、多發病之一。根據2015年全球疾病負擔研究結果顯示，全球哮喘患者高達3.58 億[1]，成人哮喘患病率約為10%[2]，隨著城市化、工業化等現代文明的發展，近年來哮喘平均患病率呈上升趨勢，預計到2025年可達4 億。兒童和青年人具有較高的哮喘發病率，是哮喘發病的主要人群，而老年人哮喘的發病率與青年人相似，且致死率更高，這可能與老年人存在基礎疾病有關[3]。現代醫學治療哮喘能較好改善患者的哮喘癥狀，但在個體和人群中，哮喘治療反應存在很大差異，部分患者的治療反應較差[4]。傳統醫學對哮喘的認識是以中醫理論為基礎的，在治療哮喘方面也積累了豐富的經驗[5]，針灸在防治哮喘方面有很好的療效[6]，其具有簡便、安全有效、無不良反應的優勢，在中醫臨床上有廣泛的應用。鐵死亡（ferroptosis）是新近發現的一種鐵依賴的脂質過氧化驅動的非凋亡形式的調節性細胞死亡方式，其特征是脂質過氧化物鐵依賴性地積累，引發質膜破壞，最終導致細胞死亡，其在形態、生物化學和遺傳學上均不同于凋亡、壞死和自噬[7-10]。目前關于哮喘中鐵死亡的研究較少，本課題組發現在塵螨誘導的哮喘模型中，肺組織中發生了鐵死亡[11]；Wu 等[12]發現鐵死亡誘導劑可以誘導嗜酸性粒細胞發生鐵死亡，進而改善哮喘癥狀；而Bibi 等[13]用鐵死亡誘導劑滴鼻，發現可以改善小鼠的哮喘癥狀。關于哮喘鐵死亡的機制尚不清楚，但鐵死亡的發現為哮喘發病機制研究提供了新的方向，也為針刺治療哮喘的作用機制研究提供了新的思路。本文重點對氣道炎癥在哮喘中的作用、鐵死亡的概念和調控、鐵死亡在哮喘氣道炎癥中的作用以及針灸對哮喘炎癥中細胞鐵死亡的調控作用進行梳理和介紹，以期為哮喘發病機制的研究提供新的思路和方向。

1 氣道炎癥是哮喘病理改變的核心環節

哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，臨床表現為反復發作的喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽等癥狀，同時伴有氣道高反應性（airway hyperresponsiveness，AHR）和可變的氣流受限等氣道功能障礙[14]。氣道炎癥是哮喘病理改變的核心環節，是哮喘病理過程的基本病理改變和反復發作的主要病理機制之一。氣道的炎癥反應是以氣道上皮細胞為代表的結構細胞與T 淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞（eosinophils，EOS）、中性粒細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等免疫細胞相互作用的結果，這些細胞分泌多種炎癥介質和細胞因子，并相互作用，構成復雜的免疫調控網絡，共同參與哮喘的氣道炎癥反應[15]。因此，控制哮喘氣道炎癥是治療哮喘的關鍵。

氣道上皮細胞在哮喘氣道炎癥中起主導作用。氣道上皮細胞是呼吸道黏膜免疫系統的重要組成部分，是保護人體免于病原體侵犯的第一道屏障，在哮喘氣道炎癥的發生、發展過程中起著重要作用[16]。氣道上皮細胞不僅具有屏障防御功能，還能在應激狀態下分泌炎性介質并和炎性細胞、抗原遞呈細胞相互作用，從而發揮免疫功能。氣道上皮細胞可以分泌多種細胞因子激活免疫細胞和招募炎性細胞。其中，最重要的是胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白介素-25（interleukin25，IL-25）、IL-33、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF）和嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）[17-20]。TSLP 和IL-25 可以激活樹突狀細胞，啟動Th2 型細胞應答[17]。IL-33 能與巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞和CD4+T 細胞等免疫細胞表面的ST2 受體結合，促進這些細胞釋放大量的趨化因子和Th2 型細胞因子[18]。GM-CSF 可刺激造血干細胞向粒細胞和單核細胞分化，支持EOS 存活[19]。Eotaxin 可以將Th2 細胞、EOS、嗜堿性粒細胞和肥大細胞招募到炎性反應部位發揮效應，進一步惡化哮喘炎癥[20]。

2 鐵死亡及其在哮喘中的作用

2.1 鐵死亡的概念和發生機制 鐵死亡是新近發現的一種鐵依賴的脂質過氧化驅動的非凋亡形式的調節性細胞死亡方式，其特征是脂質過氧化物鐵依賴性地積累至致死水平，在形態、生物化學和遺傳學上均不同于凋亡、壞死和自噬[7-10]。鐵死亡在電鏡下主要表現為線粒體外膜破壞、線粒體脊消失和膜密度增高，沒有細胞凋亡時出現的染色體濃縮、細胞壞死時出現的細胞器腫脹以及細胞自噬時出現的雙層膜囊泡形成[7-10]。2012年Dixon 等[21]在Cell 發表文章，正式將這種細胞死亡方式定義為“鐵死亡”。鐵死亡的最終執行者是脂質過氧化物，當過量的脂質過氧化物累積會引起質膜損傷，最終導致細胞鐵死亡[22]。因此，脂質過氧化/抗氧化失衡是細胞發生鐵死亡的關鍵。

2.2 ACSL4-LPCAT3-15LO 通路促進脂質過氧化和細胞鐵死亡 酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）-溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3（lysophosphatidylcholineacyltransferase3，LPCAT3）-15酯氧合酶（15-Lipoxygenases，15-LO）通路（ACSL4-LPCAT3-15LO 通路）是介導脂質過氧化和正向調控鐵死亡的重要通路，其表達上調會促進細胞內磷脂過氧化物的積累，導致細胞鐵死亡[23]。ACSL4 是鐵死亡通路上的一個關鍵基因，參與細胞膜中游離多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）-磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）的生物合成和重塑，促進鐵死亡的發生[24-25]。敲除胚胎成纖維細胞中的ACSL4，細胞對鐵死亡抗性增加[25]，敲除膠質瘤細胞中的ACSL4，膠質瘤細胞鐵死亡被抑制[24]。LPCAT3 是脂質合成途徑中的重要一環，其高表達會上調質膜中不飽和脂肪酸含量，提高細胞對鐵死亡的敏感性，敲低LPCAT3 表達能夠降低細胞對鐵死亡的敏感性[26]。15-LO是催化不飽和脂肪酸代謝的關鍵酶之一，其主要有15-LO1和15-LO2 2 種亞型，目前15-LO1 被證實在肺組織中有表達分布更廣泛[27]。在脂質合成過程中，上游限速酶ACSL4將乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）與花生四烯酸（arachidonic acid，AA）結合，形成長鏈多不飽和脂酰CoA（AA-CoA）。隨后在LPCAT3 作用下，AA-CoA 與PE 反應，形成PEAA，進入脂質氧化途徑。PE-AA 在15-LO 作用下，形成磷脂過氧化物。磷脂過氧化物的積累一方面會導致細胞內輔酶Q10 (Coenzyme Q10，CoQ10) 和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，另一方面會提高細胞對鐵死亡的敏感性。以上研究提示ACSL4-15LO 是形成磷脂過氧化物、促進脂質過氧化和正向調控鐵死亡的重要通路。見圖1。

2.3 SLC7A11-GSH-GPX4 通路抑制脂質過氧化和細胞鐵死亡 胱氨酸/谷氨酸逆轉運系統輕鏈亞基SLC7A11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）-GSH-谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）通路（SLC7A11-GSH-GPX4）通路，介導了抗氧化反應，具有拮抗脂質過氧化和抑制鐵死亡的關鍵作用[28-31]。胱氨酸/谷氨酸逆轉運系統（cystine/glutamate transporter, System Xc-）、GSH 和GPX4 在脂質過氧化過程中起抗氧化作用。System Xc-從細胞外攝取胱氨酸，并將細胞內的谷氨酸轉運至胞外，攝入細胞內的胱氨酸被還原為半胱氨酸，參與GSH 合成和下游脂質過氧化過程，System Xc-的活性與催化亞基SLC7A11的表達呈正相關[28]。抑制System Xc-導致的氨基酸代謝失衡會引發鐵死亡[28，32]。在胰腺導管腺癌中，抑制System Xc-減少胱氨酸攝取能夠誘導細胞發生鐵死亡[33]。System Xc-在鐵死亡中起著非常重要的作用，而SLC7A11 是調控“鐵超載介導鐵死亡”的關鍵蛋白之一。GSH 作為GPX4 的底物參與細胞內的抗氧化系統，是影響鐵死亡發生的關鍵因素[29]。GSH 缺失可導致GPX4 失活和細胞內脂質過氧化物增加，誘導肝癌細胞鐵死亡[30]。GPX4 是一類含有硒代半胱氨酸的還原酶，通過消耗GSH 將脂肪酸、磷脂和膽固醇等復合脂質中的過氧化物還原為穩定的羥基脂質，從而抑制細胞膜的鏈式氧化[31]。GPX4 占據了鐵死亡的核心位置，是清除過氧化脂質的重要途徑，其表達水平對細胞內氧化脂質的還原具有重要影響。在細胞中胱氨酸/半胱氨酸供應充足的情況下，抑制GPX4 能夠引起PUFA 氧化和脂肪酸自由基產生，導致鐵死亡[34]。在細胞中過表達GPX4 能增加鐵死亡抗性，敲低GPX4 能夠促進鐵死亡[35]。香煙煙霧誘導的慢性阻塞性肺疾病小鼠發生鐵死亡，GPX4+/小鼠表現出更明顯的脂質過氧化水平和氣道上皮細胞鐵死亡[36]。可見，SLC7A11-GSH-GPX4 通路具有拮抗脂質過氧化和抑制鐵死亡的作用。綜上所述，ACSL4-LPCAT3-15LO 與SLC7A11-GSH-GPX4 通路，分別介導了脂質的過氧化與抗氧化反應，兩者的相互制約維持著脂質氧化的平衡，并共同參與對鐵死亡的調控過程（圖1）。

2.4 氣道上皮細胞鐵死亡促進哮喘炎癥反應 15-LO 通常以游離PUFA 為底物，催化磷脂過氧化物產生，在IL-4/IL-13驅動的Ⅱ型炎癥反應中，15-LO 能與磷脂酰乙醇胺結合蛋白1（phosphatidylethanolamine-binding protein 1，PEBP1）結合，促進哮喘患者氣道上皮細胞發生鐵死亡[27]。穩定期和重癥哮喘患者的氣道上皮細胞中，均可以檢測到15-LO表達上調，且其表達水平與哮喘的嚴重程度呈正相關[37]。另有研究發現，15-LO1 能夠調控IL-13 誘導的人氣道上皮細胞粘蛋白表達[38]，促進炎癥反應。GPX4 能夠分解15-LO催化游離PUFA 產生的氧化PE，減少磷脂過氧化物堆積，抑制鐵死亡發生[27]。最新的研究發現，IL-6 通過誘導活性氧依賴的脂質過氧化促進支氣管上皮細胞鐵死亡[39]。以上研究提示，氣道上皮細胞的鐵死亡參與哮喘的炎癥反應，其在哮喘病理進展中發揮重要作用。

3 針刺對哮喘炎癥中細胞鐵死亡的調控

哮喘屬于中醫的哮病范疇，祖國醫學早在內經中就有“喘鳴”的記載，如《素問. 陰陽別論篇》中提到“起則熏肺，使人喘鳴”。明代張景岳《景岳全書. 喘促》說“喘有夙根，遇寒即發、或遇勞即發者，亦名哮喘”。哮病反復發作，難以治愈，乃是由于“內有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰，三者相合，閉拒氣道，搏擊有聲，發為哮病”。臨床和系列實驗研究證實了針刺治療哮喘的有效性[40-43]。臨床研究結果表明，針刺治療對于提高哮喘的控制水平，改善患者生活質量具有重要作用。系列實驗研究結果顯示針灸治療哮喘的作用主要體現在調節免疫和抑制炎癥方面。鐵死亡在哮喘炎癥中的作用以及針刺對哮喘鐵死亡的調控作用的相關研究尚處于起步階段。本課題組運用蛋白組學技術研究了針刺治療哮喘的相關作用機理[44]，結果顯示，哮喘的病理過程與鐵死亡密切相關，針刺治療哮喘能夠調控鐵死亡的相關環節，有效延緩哮喘氣道炎癥和病情進展。研究發現，卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的小鼠哮喘模型中，除了典型的氣道炎癥相關變化外，還發生了鐵死亡相關改變，表現為丙二醛（malonaldehyde,MDA）明顯升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和GSH 明顯降低。給予針刺治療后，氣道炎癥明顯緩解，MDA 表達明顯下調，SOD 和GSH 明顯上調。此外，針刺治療哮喘還能夠調控鐵死亡通路中SLC3A2 和谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase, GCL) 表達，因此認為針刺治療哮喘的效應與調控鐵死亡相關。但是，針刺治療哮喘究竟如何調控鐵死亡，還需要進一步深入的研究。

4 展望

哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，針灸治療哮喘具有良好的療效，但是針灸抗哮喘效應的具體作用機理尚未完全闡明，限制了針刺療法在哮喘臨床治療中的廣泛應用。鐵死亡是新發現的一種程序性細胞死亡方式，其在哮喘發病機制中的作用日益受到關注。同時，針刺通過調控鐵死亡信號發揮抗哮喘作用也被初步證實，這為闡明針刺治療哮喘的療效機理提供了新的思路。然而，目前相關研究仍處于起步階段，針刺調控哮喘發病過程中出現的鐵死亡事件具體涉及哪些細胞，以及與哮喘病理變化存在何種關系，仍是需要深入研究的方向。另外，針刺調控了哪些細胞的鐵死亡而發揮抗哮喘療效，也是值得關注的重點。

注：Glutamate：谷氨酸；Cystine：胱氨酸；Cysteine：半胱氨酸；ACSL4：酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4）；LPCAT3：溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3）；15-LO1： 15 酯氧合酶1（15-Lipoxygenases-1）；GSH：谷胱甘肽（glutathione）; GPX4：谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4）；Lipid Peroxides：脂質過氧化；Ferroptosis：鐵死亡；CoA：乙酰輔酶A（coenzyme A）；AA：花生四烯酸（arachidonic acid）；PE：磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine）