LRP1-pPyk2-MMP9通路在高氧誘導新生大鼠肺損傷中的作用

鄭亞斐 朱海艷 王維 胡晶晶 包天平 田兆方

（南京醫科大學附屬淮安第一醫院新生兒科/淮安市小兒呼吸診療重點實驗室，江蘇淮安 223300）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產兒常見的慢性肺部疾病，由肺損傷和未成熟肺的修復之間的不平衡引起［1］。此外，BPD還會對神經系統和其他系統器官造成損害［2］。由于目前BPD 缺乏有效的治療方法，因而針對其發病機制的研究以便實現精準治療一直是新生兒學的熱點話題。

低密度脂蛋白受體相關蛋白1（low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1） 是本課題組在前期臨床試驗中通過數據非依賴采集質譜技術，從BPD 患兒與非BPD 患兒的血漿中篩選并得到驗證的差異表達蛋白［3］。這提示LRP1可能涉及BPD 發病機制。LRP1 是一種普遍存在的I型跨膜受體，可介導多種途徑的信號轉導，涉及蛋白酶降解、炎癥調節、細胞生長、細胞存活和遷移等［4］；還可結合內吞40 多種結構和功能不同的配體，包括載脂蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制復合物和細胞外基質蛋白，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和尿激酶型纖溶酶原激活物［5］。MMPs是一種鋅依賴的蛋白水解酶，具有消化細胞外基質蛋白的能力，在生理和病理條件下都在細胞外基質重塑中發揮重要作用［6］。MMPs不僅參與炎癥和致癌過程的啟動和調節，還參與胚胎發育和器官成熟（包括肺）［7］，其在BPD進展中具有的作用已得到公認［8-9］，近年來MMP9 在BPD的作用受到重視［10-11］。酪氨酸激酶2（prolinerich tyrosine kinase 2，Pyk2）是一種富含脯氨酸的非受體酪氨酸激酶，可由細胞內鈣水平升高而激活，還可被多種其他信號激活，如毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1、蛋白激酶C、生長因子、活性氧等［12］，pPyk2是其磷酸化形式。目前已有文獻報道在血管平滑肌細胞［13］和成纖維細胞［14］中存在LRP1-pPyk2-MMP9信號通路。相關實驗結果表明，pPyk2 與 LRP1β 鏈發生作用，且 pPyk2 和 MMP9 的特異性熒光在動脈粥樣硬化斑塊的血管細胞中重疊［13］。另外，共聚焦顯微鏡圖像顯示，pPyk2、MMP9 和LRP1 共定位于心肌梗死后的心肌成纖維細胞中［14］。但目前尚未有 LRP1-pPyk2-MMP9 通路參與BPD 發病的相關報道。因此，本研究旨在通過高氧誘導新生大鼠BPD 模型研究LRP1-pPyk2-MMP9信號通路的變化，為BPD的發病機制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

Sprague-Dawley 大鼠飼養于南京醫科大學附屬淮安第一醫院SPF級動物房，嚴格執行實驗動物管理條例。將出生時間相差半小時以內的新生大鼠16只，雌雄不限，體重6～8 g，隨機分配至空氣對照組（吸入氧濃度=21%，空氣組）、高氧模型組（吸入氧濃度＞95%，高氧組），每組8 只。本實驗取得南京醫科大學附屬淮安第一醫院動物實驗倫理委員會批準。高氧組新生大鼠按本實驗室方法于生后即置于＞95%氧濃度環境中持續暴露7 d 建立高氧肺損傷模型［15］，空氣組僅暴露于同室空氣環境中，適時補充飼料和水，更換墊料。空氣暴露和高氧暴露的母鼠每24 h 互換，以免母鼠因氧中毒影響新生鼠的哺乳喂養，交換母鼠過程輕拿輕放，防止母鼠激惹發生食子現象，記錄大鼠生長情況。

1.2 標本收集

兩組大鼠均于生后第8天稱重后腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，采用心臟取血法留取血1～2 mL。頸正中暴露氣管，剪開一小口插入導管并固定，向導管內緩緩注入1 mL預冷0.9%氯化鈉溶液反復回抽3 次，回收率80%～90%，留取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。快速剪開胸腔，取出雙側肺臟，肉眼觀察后，用PBS沖洗；左上肺制成肺組織勻漿，右上肺組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續切片，厚度為5 μm，供免疫組化和組織學檢查用。

1.3 肺組織病理檢查

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后觀察肺組織病理學改變，以輻射狀肺泡計數（radical alveolar counts，RAC）評估肺泡發育程度，在100倍光鏡視野下，隨機選取5個視野，計數肺泡數并取其均值。

1.4 ELISA法測定血清可溶性LRP1和MMP9水平

采血后室溫下靜置2 h，再置4℃冰箱3～4 h，待血液凝固血塊收縮后，4 000 r/min 離心10 min，取上清，保存于-80℃冰箱中。取BALF 于1 h 內4 000 r/min 離心10 min，取上清，保存于-80℃冰箱中。采用可溶性LRP1（soluble LRP1，sLRP1）（江蘇酶免實業有限公司）、MMP9（武漢三鷹生物技術有限公司）ELISA試劑盒，按照產品說明書檢測血清及BALF中相應指標的濃度。

1.5 Western blot檢測蛋白水平

肺組織勻漿用BCA 法測定蛋白濃度，待測樣品以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，然后把膠上的蛋白電轉移到醋酸纖維膜上，5%無脂奶粉封閉，分別與兔抗鼠GAPDH 多克隆抗體一抗（Gentex，美國）（稀釋度為1∶5 000）、兔抗鼠LRP1單克隆抗體一抗（Abcam，英國）（稀釋度為1∶5 000）、兔抗鼠Pyk2單克隆抗體一抗（Abcam，英國）（稀釋度為1∶5 000）、兔抗鼠pPyk2多克隆抗體一抗（Affinity，美國）（稀釋度為1∶2 000）、兔抗鼠MMP9多克隆抗體一抗（Proteintech，美國）（稀釋度為1∶2 000）孵育雜交，4℃過夜洗膜后，再加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后進行顯色，曝光于X線膠片上，在圖像分析系統計算目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值，代表目的蛋白的相對表達量。

1.6 Real-Time PCR法檢測mRNA相對表達量

TRIzol 法抽提2 組大鼠肺組織總RNA（美國Invitrogen公司），采用逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測LRP1 mRNA、MMP9 mRNA的表達變化，逆轉錄試劑盒及聚合酶鏈反應試劑盒購自日本Takara 公司。熒光定量聚合酶鏈反應體系為20 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物 （10 μmol/L）各 0.8 μL， ROX 0.4 μL， cDNA 2.0 μL， dH2O 6.0 μL。反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40 個循環；溶解曲線為95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。擴增引物序列LRP1-F： 5'-CCACTATGGATGCCCCTAAAAC-3'， LRP1-R：5'-GCAATCTCTTTCACCGTCACA-3'；MMP9-F：5'-CCCTGCGTATTTCCATTCAT-3'， MMP9-R： 5'-AAACCCCACTTCTTGTCAGC-3'； GAPDH-F： 5'-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3'， GAPDH-R：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計學軟件對所有數據進行統計學比較分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠生長狀況

空氣組大鼠活動良好、反應靈敏、毛發光澤、膚色紅潤，無異常表現。高氧組大鼠反應遲鈍、精神萎靡、活動減少，毛發發澀、無光澤，皮膚蒼白、干燥，口周發紺，氧依賴表現明顯，體重增長較空氣組緩慢（P＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠生后各時間點體重比較 （，g）

表1 兩組大鼠生后各時間點體重比較 （，g）

images/BZ_106_1284_764_1431_827.pngimages/BZ_106_1431_764_1504_827.pngimages/BZ_106_1504_764_1689_827.pngimages/BZ_106_1689_764_1874_827.pngimages/BZ_106_1874_764_2059_827.pngimages/BZ_106_1284_945_1431_1063.png空氣組高氧組8 8images/BZ_106_1431_945_1504_1063.pngimages/BZ_106_1504_945_1689_1063.png7.5±0.4 7.5±0.6images/BZ_106_1689_945_1874_1063.png10.6±0.6 9.8±1.7images/BZ_106_1874_945_2059_1063.png13.8±1.2 12.1±1.4第7天15.8±0.8 13.0±1.2 5.732＜0.001

2.2 大鼠肺組織病理變化

HE 染色結果顯示，空氣組大鼠肺組織結構完整；高氧組可見肺泡數減少，肺泡大小不均一，肺泡間隔水腫增厚及纖維化（圖1）。空氣組RAC值 （19.1±2.0） 大 于 高 氧 組 （13.2±1.7）（t=6.321，P＜0.05）。提示BPD小鼠模型構建成功。

圖1 兩組大鼠肺組織病理切片

2.3 兩組大鼠sLRP1及MMP9水平變化

高氧組大鼠血清及BALF 中sLRP1、MMP9 水平均高于空氣組（P＜0.05），見表2～3。

表2 兩組大鼠血清中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

表2 兩組大鼠血清中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

注：［sLRP1］ 可溶性低密度脂蛋白受體相關蛋白1；［MMP9］基質金屬蛋白酶9。

231±94 1 332±376images/BZ_106_1284_2764_1549_2826.pngimages/BZ_106_1549_2764_1686_2826.pngimages/BZ_106_1686_2764_1965_2826.png8 8images/BZ_106_1965_2764_2243_2826.pngimages/BZ_106_1284_2945_1549_3063.png空氣組高氧組images/BZ_106_1549_2945_1686_3063.pngimages/BZ_106_1686_2945_1965_3063.png55±8 100±14images/BZ_106_1965_2945_2243_3063.png

表3 兩組大鼠BALF中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

表3 兩組大鼠BALF中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

注：［sLRP1］ 可溶性低密度脂蛋白受體相關蛋白1；［MMP9］基質金屬蛋白酶9。

MMP9 88±30 530±130 9.375＜0.001images/BZ_107_237_471_465_534.pngimages/BZ_107_465_471_642_534.pngimages/BZ_107_642_471_919_534.png8 8images/BZ_107_237_652_465_770.png空氣組高氧組images/BZ_107_465_652_642_770.pngimages/BZ_107_642_652_919_770.png13±6 76±21

2.4 Western blot 法檢測兩組大鼠肺組織勻漿蛋白表達變化

LRP1、MMP9 蛋白在高氧組的表達水平明顯高于空氣組（P＜0.05）。pPyk2蛋白在高氧組的表達水平較空氣組也明顯升高（P＜0.05），但Pyk2蛋白水平在兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

圖2 Western blot法檢測兩組大鼠肺組織勻漿LRP1、pPyk2、MMP9蛋白表達電泳圖

表4 兩組大鼠肺組織勻漿蛋白相對表達量比較 （）

表4 兩組大鼠肺組織勻漿蛋白相對表達量比較 （）

注：［LRP1］低密度脂蛋白受體相關蛋白1；［MMP9］基質金屬蛋白酶9；［pPyk2］磷酸化酪氨酸激酶2；［Pyk2］酪氨酸激酶2。

Pyk2 0.50±0.04 0.52±0.05 0.666 0.530images/BZ_107_237_2017_374_2073.pngimages/BZ_107_374_2017_438_2073.pngimages/BZ_107_438_2017_627_2073.png4 4images/BZ_107_627_2017_817_2073.pngimages/BZ_107_817_2017_1006_2073.pngimages/BZ_107_237_2187_374_2300.png空氣組高氧組images/BZ_107_374_2187_438_2300.pngimages/BZ_107_438_2187_627_2300.png0.69±0.06 0.94±0.09images/BZ_107_627_2187_817_2300.png0.60±0.05 0.79±0.07images/BZ_107_817_2187_1006_2300.png0.92±0.08 1.22±0.09

2.5 RT-PCR 法檢測兩組大鼠肺組織勻漿sLRP1及MMP9的mRNA水平變化

高氧組LRP1 mRNA 和MMP9 mRNA 的相對表達量均高于空氣組（P＜0.05），見表5。

表5 兩組大鼠LRP1及MMP9的mRNA水平比較 （）

表5 兩組大鼠LRP1及MMP9的mRNA水平比較 （）

注：［LRP1］低密度脂蛋白受體相關蛋白1；［MMP9］基質金屬蛋白酶9。

MMP9 1.04±0.32 2.91±0.88 3.461 0.026images/BZ_107_239_2891_480_2947.pngimages/BZ_107_480_2891_635_2947.pngimages/BZ_107_635_2891_929_2947.png6 6images/BZ_107_239_3061_480_3174.png空氣組高氧組images/BZ_107_480_3061_635_3174.pngimages/BZ_107_635_3061_929_3174.png0.99±0.06 11.96±0.59

3 討論

BPD 易發生在接受機械通氣的早產兒中，并可能最終導致長期肺部疾病［16］。然而，BPD 的發病機制尚未完全了解，可能與肺泡和血管肺發育停滯、纖維化和慢性炎癥有關［17］。目前研究已發現，MMPs在BPD進展中發揮著核心作用，主要影響BPD 肺發育停滯和組織重塑纖維化過程［18］，其中MMP9受到了高度重視。

本研究發現在高氧組出現肺組織間質水腫，肺泡腔可見水腫液形成、炎癥細胞浸潤及肺泡出血；血清和BALF 中MMP9 水平均較空氣組明顯升高，肺組織勻漿中MMP9 蛋白表達也增加，與Tambunting 等［19］研究相符。MMP9 在 BPD 中的功能已被研究［20］，但其涉及的相關通路尚未明確。最新研究發現，MMP9的活性不僅受到其組織抑制劑 的 調 節［21］， 還 通 過 ERK1/2［22］、 NF-κB［23］、STAT3［24］、TRPV4［25］、ADAM17［26］等蛋白介導在肺相關疾病中發揮作用。近年來，有人提出MMP9可能還與LRP1密切相關［27］。

LRP1目前在肺部疾病中的作用受到廣泛關注，在人類全基因組關聯研究中，LRP1 的單核苷酸多態性與人類肺功能相關［28］，在平滑肌細胞中LRP1的失調影響基線肺功能和氣道反應性［29］；肺泡巨噬細胞上LRP1的表達介導其吞噬作用并調節炎癥介質的釋放［4］；成纖維細胞中LRP1表達的失調可能導致收縮性肌成纖維細胞無限制擴張，從而導致纖維化的發展［30］。另外，有文獻表明，LRP1與血管形成和新生血管有關［31］。LRP1通過蛋白水解從細胞表面脫落釋放出sLRP1。sLRP1可促進巨噬細胞炎癥介質的表達；還可競爭性結合細胞外蛋白，阻止它們的內吞作用［32］。本研究發現，肺組織勻漿中LRP1 mRNA 及LRP1 蛋白表達均增加；高氧組血清和BALF 中sLRP1 水平均較空氣組升高，而我們前期臨床研究中的BPD患兒血清sLRP1水平升高，這提示LRP1 在高氧誘導的肺損傷及BPD發病中可能具有重要作用。

本研究還發現LRP1 與MMP9 表達水平呈正相關，有研究認為LRP1不僅介導MMP9的內吞作用，還作為膜受體傳遞細胞內信號，誘導MMP9 表達［33］。但是LRP1 在高氧誘導肺損傷中調控MMP9的具體機制尚未清楚。

本研究結果顯示，在高氧組中肺組織勻漿pPyk2 表達增加。Pyk2 在多種疾病中發揮重要作用：在氣道高反應性疾病中，Pyk2 磷酸化水平升高，會導致囊性纖維化氣道平滑肌功能異常［34］；Pyk2 可通過激活缺氧誘導因子而加重肺動脈高壓［35］；在缺血再灌注后，Pyk2 激活原存活信號分子，防止活性氧過度增加，從而對缺血再灌注損傷起到保護作用［36］。Revuelta-López 等［13］證實了在缺氧相關的血管疾病中存在LRP1-pPyk2-MMP9信號通路，LRP1 可通過增加細胞內鈣水平，上調富含脯氨酸的Pyk2磷酸化，誘導MMP9表達增加。其研究結果表明心肌梗死后心肌成纖維細胞LRP1水平在MMP9表達上調及心室重構相關機制中發揮重要作用［14］，并強調 LRP1-pPyk2-MMP9 軸參與了血管細胞遷移過程［37］。

綜上所述，本研究發現在高氧誘導新生大鼠肺損傷中，肺組織LRP1表達上調，Pyk2磷酸化水平增加，MMP9水平升高，提示LRP1-pPyk2-MMP9通路可能參與了BPD 的發病機制，但本文未對這條通路上下游行進一步干預研究，如基因敲除或過表達等，未來針對這條通路的研究可能為BPD的發病研究提供新的思路。