利用CRISPR/Cas9技術進行lncRNA snhg17-KO基因敲除小鼠模型的構建與鑒定*

許 靜 高 琳 洪馬林 趙 盼

暨南大學第二臨床醫學院 深圳市人民醫院 1 病理科 2 臨床醫學研究中心，廣東省深圳市 518000

隨著對人類基因組研究數據的不斷探索發現，非編碼RNA在整個基因組中占據98%的作用，長鏈非編碼RNA簡稱lncRNA，是一種長度>200個核苷酸，但不具有蛋白質編碼功能的序列RNA。研究表明，lncRNA作用于細胞的增殖、分化、凋亡及免疫功能，并且與各種腫瘤密切相關，參與腫瘤的發生、發展過程[1-2]。一類長度在60～300個核苷酸，表達在核內的小核RNA(snRNA)，常存于宿主基因內含子中，發揮著抑制或促進腫瘤細胞增殖的功能。而小核RNA宿主基因17(Small nucleolar RNA host gene 17，snhg17)作為一種重要的lncRNA，在肺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤組織表達上調，且與臨床預后及分期顯著相關[3-5]。迄今為止對于snhg17在乳腺惡性腫瘤的具體分子機制，尚未見相關報告。因此探討snhg17的功能，對于發現乳腺腫瘤特異性標志物及治療預后具有深遠的研究意義。

動物模型作為一種非常實用的實驗研究工具，可以模擬出腫瘤的免疫表型，因此構建snhg17-KO基因敲除小鼠模型，對于后續實驗研究具體機制及探尋腫瘤治療至關重要。使用細胞生物手段解析靶基因功能的基因編輯技術，其中CRISPR/Cas9系統，具有高效、簡單的優勢，被實驗室廣泛應用，該項技術包括兩個重要步驟：一是Cas9蛋白執行剪切功能；二是guide RNA(gRNA)特異性將Cas9蛋白引導至靶DNA序列[6-7]。我們讓gRNA與Cas9蛋白結合構成復合物，使用gRNA引導并識別目的基因靶點，再進行Cas9蛋白對目標序列的切割。本研究擬通過選取snhg17基因1-6號的外顯子，進行gRNA條件性有效敲除C57BL/6小鼠基因組中的snhg17基因，以達到構建snhg17-KO基因敲除小鼠模型的目的，為后續深入探討snhg17在腫瘤中的分子機制提供優質的實驗動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 C57BL/6小鼠購于北京維通利華實驗動物技術公司，動物實驗經由深圳市人民醫院動物委員會批準,飼養于深圳市人民醫院SPF級實驗動物中心,實驗分組：實驗組小鼠(KO組)、對照組小鼠(CON組)、未注射的空白組小鼠(WT組)。M16培養基購于德國MERCH公司；pRP[CRISPR]-hCas9-U6載體購于美國Addgene公司，PCR引物及探針由上海生工合成；提取總RNA試劑、Lipofectamine 2000轉染試劑盒及Omega試劑盒購于Invitrogen公司；pEASY-BLUNT Zero Cloning Kit載體連接試劑盒和Trans1-T1感受態細胞購于Trangene公司；DNA Pst I限制性核酸內切酶、高保真DNA聚合酶FastPfu購于Takara公司；0.5 M EDTA、3 M醋酸鈉購于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 載體設計及構建：依據CRISPR/Cas9技術 gRNA設計原理，采用數據庫(https://zlab.bio/guide-design-resources)設計2對用于CRISPR/Cas9技術的gRNA，對位于小鼠2號染色體上的snhg17基因(Gene ID：68108)第3和第6外顯子作為靶點，通過比較評分，選出效率高的gRNA3和gRNA4序列(表1)。構建至pRP[CRISPR]-hCas9-U6載體中，通過VectorBuilder構建帶有Cas9質粒的融合質粒進行質粒構建。

表1 sgRNA序列

1.2.2 質粒轉化與提?。簩?.1μl的質粒與DH5α 42°C水浴混勻，取900μl LB培養基， 37℃45min震蕩培養，使菌體復蘇，取20μl菌體種板，37°C培養16h，篩選單克隆菌落，加4μl 100μg/ml Amp培養，用于質粒提取。采用Omega試劑盒在5ml LB培養基中加入目標質粒的E.coli，37℃振蕩培養，取1.5ml菌液加入250μl(含RNase A)溶液，得到裂解液，離心取上清，與0.5倍100%乙醇混合，至2ml吸收柱反復清洗，滴加50μl無菌水在濾膜上離心。DNA檢測：分光光度計檢測，OD 260/280=1.8。

1.2.3 體外轉錄模板擴增及轉錄： 設計合成擴增引物(表2，下劃線示T7啟動子區域)。取pRP[CRISPR]-hCas9-U6質粒20ng，加入無酶雙純水50μl，含Mg2+擴增緩沖液25μl，dNTP1μl，DNA聚合酶1μl，上游及下游引物1μl，所有操作均在冰上進行。PCR反應程序：預變性95℃ 30min,變性95℃ 15s, 退火65℃15s,延伸72℃ 30s，35個循環；72℃ 5min。在反應體系液中加入PCR擴增產物，37℃溫育1h，使用1μl TURBO DNase，1μl 0.5M EDTA進行體外轉錄并純化，得到分離的gRNA3、gRNA4和Cas9蛋白的mRNA。

表2 體外轉錄模板擴增的引物序列

1.2.4 構建動物模型：(1)小鼠飼養：所有實驗分組小鼠均飼養在深圳市人民醫院清潔SPF級標準的中心實驗室動物房，保持室溫25℃，50%～60%濕度值，光照和黑暗12h交替循環，每日自由采食，墊料、水、飼料均經高壓高溫滅菌處理供給。(2)取受精卵：選取12周C57BL/6雌鼠誘導排卵，腹部注射促性腺激素(PMSG)120U/kg，與雄鼠交配，使用透明質酸酶消化剪取輸卵管組織，顯微鏡下收集受精卵，37℃，5% CO2M16培養基培養。(3)顯微注射：收集和培養C57BL/6小鼠受精卵，將注射針吸入gRNA3/Cas9和gRNA4/Cas9轉錄產物約0.5μl，插入卵核仁內注射。(4)植入代孕鼠：將受精卵植入代孕小鼠生殖系統，進行篩選并繁育F0代小鼠。

1.2.5 繁育snhg17雜合和純合突變小鼠：待轉染gRNA3與gRNA4的受精卵小鼠出生成熟后，再與WT小鼠(野生型)繁殖，得到的即為F1代。通過基因型鑒定出的F1代雜合子基因敲除小鼠，雌雄交配繁殖出F2代,再進行基因鑒定,最終得到兩條染色體均帶有snhg17突變基因的純合突變小鼠。

1.2.6 小鼠基因型鑒定：剪取鼠尾并破碎，提取DNA使用TaKaRa MiniBEST 全基因組DNA提取試劑盒，PCR進行擴增目的片段同時行目的條帶的電泳檢測。PCR反應體系：加入1.5μl鼠尾基因組DNA,1.5μl dNTP，1.0μl Mg+緩沖液，0.5μl引物混合液，0.5μl DNA聚合酶，21.8μl ddH2O。PCR反應條件：預變性94℃ 5min；變性94℃ 30s；退火60℃ 30s；延伸72℃ 60s；循環35次，72℃再次延伸5min。為進一步驗證,進行產物基因測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，采用獨立樣本t檢驗比較組間均數，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠snhg17 gRNA構建與篩選 使用張峰實驗室(https://zlab.bio/guide-design-resources)數據庫,設計gRNA, snhg17位于小鼠2號常染色體上，已確定有6個外顯子(exon)，選擇exon 1～exon 6區作為目標區域(圖1所示)。設計2對評分較高的gRNA：gRNA1和gRNA2、gRNA3和gRNA4，最終選擇效率高的gRNA3和gRNA4進行基因打靶。

圖1 gRNA設計策略

2.2 F1代snhg17雜合子小鼠的構建及基因型鑒定 在gRNA3和gRNA4區域兩側設計兩對引物，用于小鼠的基因型測定(圖2a)。F0代與WT小鼠繁殖得到的F1代，用于提取鼠尾DNA，PCR擴增電泳顯示目的條帶。圖2b表明snhg17 gRNA是否打靶成功，如圖所示，圖中3、6、7、8、9、17、18、19號小鼠均打靶成功，敲除了目的片段。圖2c表明snhg17 gRNA打靶成功，圖中3、6、7、8、9、17、18、19號小鼠的電泳結果中顯示出2條帶，分別為650bp和437bp，表明雜合子敲除小鼠打靶成功，而WT小鼠僅有437bp處的一條帶。圖2d表明有4 202bp的基因被敲除，符合預期gRNA3和gRNA4的打靶條帶大小。

圖2 snhg17基因敲除雜合子小鼠的驗證a.gRNA設計策略 b.DNA電泳檢測snhg17敲除小鼠的基因型情況 c.DNA電泳檢測snhg17敲除小鼠的基因型情況 d.檢測目的基因打靶效果

2.3 F2代snhg17純合子小鼠的構建及基因型鑒定 設計4對引物用于驗證F2代的基因型(圖3a示)。PCR擴增電泳顯示目的條帶。圖3b表明snhg17 gRNA是否打靶成功，其中8號小鼠打靶成功，敲除了目的片段。圖3c表明snhg17 gRNA打靶成功，8號小鼠的電泳結果中顯示僅有650bp 處有1條帶，表明純合子小鼠敲除打靶成功，而雜合子在840bp和650bp處各有一條帶，WT小鼠在840bp處有一條帶。圖3d中8號小鼠的電泳結果中顯示僅有650bp 處有一條帶，表明純合子敲除小鼠打靶成功，而雜合子在437bp和650bp處各有一條帶，WT小鼠在437bp處有一條帶。圖3e中8號小鼠在694bp處沒有條帶，表明純合子敲除小鼠打靶成功，而在694bp處有條帶的小鼠則為雜合子或WT小鼠。圖3f表明有4 202bp的基因被敲除，符合預期gRNA3和gRNA4的打靶條帶大小。

圖3 snhg17基因敲除純合子小鼠的驗證a.驗證引物設計策略 b.DNA電泳檢測PCR region 1目的片段擴增情況 c.DNA電泳檢測PCR region 2目的片段擴增情況 d.DNA電泳檢測PCR region 3目的片段擴增情況 e.DNA電泳檢測PCR region 4目的片段擴增情況 f.檢測目的基因打靶效果

3 討論

隨著分子生物基因測序的應用，逐步建立起大量生物信息數據庫，從而加速了對lncRNA這類非編碼RNA作用機制的認識。lncRNA長度>200核苷酸，研究表明其缺乏開放性閱讀框，但在5’端可加帽、剪接，3’端可被聚腺苷酸化， RNA聚合酶Ⅱ可以被轉錄，因此lncRNA被認為是一種結構性RNA、分子支架，參與并調節細胞遺傳方面的功能，同時也是調控著miRNA的“分子海綿”[8]。

存在于核內的snoRNA，長度為60～300核苷酸，其宿主基因為lncRNA，在腫瘤進展中起到抑制或促進功能。snhg17基因位于20號染色體p12上，是這些宿主基因中重要的一員[9]。已被證實，在肺癌、胃癌中的表達上調，并且通過表觀遺傳方式，進一步調節了p15及 p57蛋白，達到促進腫瘤細胞的增殖及侵襲[3]，另外在腸道腫瘤、乳腺腫瘤及惡性黑色素瘤中發揮致癌活性[10-12]，然而目前對于其具體分子機制尚不十分明了。通過對人的胃癌組織進行轉錄組測序后發現，snhg眾多亞型中snhg2與snhg5在腫瘤組織中的表達量下調，而snhg17的轉錄水平上調，證明snhg17參與胃腫瘤的發生發展[13]。此外，有研究證明乳腺癌患者腫瘤組織snhg17的耗竭抑制了體外細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制了異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。snhg17可以充當BC細胞中miR-124-3p的內源海綿，通過海綿miR-124-3p調節BC的進程[12]。因此，深入研究snhg17在腫瘤中的作用機制非常重要，開發新型靶點藥物對臨床腫瘤治療提供一種探索性科學理論依據。

由于小鼠與人類基因組有99%同源，同時易于引導特定基因的定向改變，允許基因精確的改變，因此采用建立動物模型的方式對臨床疾病尤其腫瘤方面的機制探索具有重要意義。目前進行基因敲除小鼠的構建主要通過兩種方法，一使用同源重組代替內源基因實現敲除目的，或者通過啟動子/polyA捕獲實現敲除。常用的技術手段有Cre/loxP、CRISPR/Cas9、ZFN和TALEN技術[14]。Cre/loxP系統是通過在靶位點兩端設計loxP序列，經Cre酶處理后，兩者方向相同，目的基因會被刪除；兩者相反則會被置換。但Cre/loxP技術在應用于基因工程小鼠模型上時價格昂貴并且耗時；ZFN技術特異性切割目的基因序列引起雙鏈DNA斷裂，從而啟動了 DNA修復機制，進行定向修復；而TALEN技術是根據靶基因序列變換雙氨基酸殘基(RVDs)，由轉錄激活因子樣效應物(TALE)與靶點結合，被FokI切割以完成基因定點敲除。此外，TALEN結合靶基因序列更嚴格，靶向效率高，同時也能夠降低脫靶效應等。然而，TALEN更適合于針對蛋白編碼基因基因敲除，對于非編碼基因并不適用。

CRISPR/Cas9技術價格經濟，而且基因敲除長達20kb，有研究表明，在原發性肉瘤中將CRISPR/Cas用于建立基因工程小鼠模型后與Cre/loxP技術相比，CRISPR/Cas9能夠更快地使細胞突變，在可控時間和空間下迅速產生并引發肉瘤形成，得到可靠的基因編輯小鼠[15]，因此通過CRISPR/Cas9技術達到了敲除snhg17基因的目的。在本實驗研究中使用體外轉錄產物而沒有采用質粒的原因：由于質粒載體比較穩定，若直接注射質粒載體到受精卵中，則會在小鼠受精卵至胚胎時期存在較長時間，這樣會導致在不同時期切割而產生嵌合體，不利于后期基因分型，另外質粒還有可能隨機整合在基因組中。而注射轉錄后產物較不穩定，會在受精卵時期逐步降解，減少嵌合體的產生，方便后期基因分型，因此實驗選擇體外轉錄后注射方式。

綜上所述，本研究應用CRISPR/Cas9技術在C57BL/6小鼠中敲除snhg17，通過PCR及測序基因型鑒定，成功構建了snhg17基因敲除小鼠，為探尋snhg17在腫瘤發生發展中的作用機制研究提供可靠的動物模型。