浙江省西 (甜) 瓜蔓枯病菌對(duì)甲基硫菌靈和啶酰菌胺的抗性檢測(cè)及抗性機(jī)制

吳倩倩, 莊超杰, 吳鑒艷, 張傳清

(浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，杭州 311300)

西瓜Citrullus lanatus和甜瓜Cucumis melo均為葫蘆科 (Cucurbitaceae) 經(jīng)濟(jì)水果，在蔬菜瓜果產(chǎn)業(yè)中占有重要地位[1]。2019 年浙江省西 (甜) 瓜收獲面積和產(chǎn)量分別為8.28 萬(wàn)公頃和246.7 萬(wàn)噸，占全國(guó)西 (甜) 瓜收獲面積和產(chǎn)量的4.28%和3.26%[2]。作為一種世界范圍內(nèi)的重要侵染性病害，蔓枯病在西 (甜) 瓜整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段均可發(fā)病，會(huì)對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。田間植株的發(fā)病率一般在20%～40%之間，在溫室種植和連作時(shí)，植株發(fā)病率可高達(dá)80%，藤蔓發(fā)病率約為10%。危害嚴(yán)重時(shí)，減產(chǎn)率甚至能達(dá)15%[3]。

化學(xué)防治是目前防治蔓枯病的主要措施之一。過(guò)去中國(guó)常使用苯并咪唑類殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈防治西甜瓜上包括炭疽病、枯萎病和蔓枯病等多種病害，在田間表現(xiàn)出了良好的防治效果[4]，但由于該類殺菌劑的作用位點(diǎn)單一，連續(xù)大面積使用，病原菌極易對(duì)其產(chǎn)生抗性[5]，而蔓枯病在西 (甜) 瓜整個(gè)生育期內(nèi)均可發(fā)生，在長(zhǎng)期的施藥過(guò)程中，蔓枯病菌也可能對(duì)該類藥劑產(chǎn)生抗性。琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHIs) 殺菌劑的代表品種啶酰菌胺對(duì)蔓枯病菌具有較好的防治效果。

苯并咪唑類殺菌劑主要通過(guò)作用于真菌微管的功能和組裝，最終抑制細(xì)胞的有絲分裂[6-7]。有研究表明，植物病原真菌在田間對(duì)這類殺菌劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制主要為其β-tubulin基因的第198 位和200 位密碼子的點(diǎn)突變[8]。SDHIs 殺菌劑作用于真菌琥珀酸脫氫酶[9]，目前報(bào)道的抗藥性菌株的突變位點(diǎn)主要發(fā)生在Sdh B，其次為Sdh C 和Sdh D。2015 年，Hendricks 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，佛羅里達(dá)州西瓜蔓枯病菌對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗性是由于其Sdh B上的H277Y 或H277R 突變導(dǎo)致的，這與2012 年Avenot 等[11]報(bào)道的西瓜蔓枯病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性機(jī)制一致。本研究檢測(cè)了浙江省蔓枯病菌對(duì)甲基硫菌靈和啶酰菌胺的抗性，并分析了抗藥性機(jī)制，以期為生產(chǎn)中蔓枯病菌對(duì)兩種藥劑的抗性管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基及藥劑

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA) 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

藥劑：97%甲基硫菌靈 (thiophanate-methyl，以下簡(jiǎn)稱Ben) 原藥，由江西正邦生物化工股份有限公司提供；97%啶酰菌胺 (boscalid，以下簡(jiǎn)稱Bos) 原藥，由浙江天一農(nóng)化有限公司提供。均用丙酮作溶劑，啶酰菌胺配制成5 × 104μg/mL 的母液，甲基硫菌靈配制成2 × 104μg/mL的母液，于4 ℃下貯存，備用。

1.2 菌株采集與分離

從浙江省臺(tái)州、溫州、金華、湖州和寧波5 市的西 (甜) 瓜大棚或田塊采集蔓枯病發(fā)病的莖和葉，每個(gè)大棚或田塊采集1～5 株，每個(gè)病樣用采樣袋單獨(dú)包裝。采用組織分離法[12]從病健交界處切取5 mm × 5 mm 組織塊，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒30 s、3%的次氯酸鈉消毒3 min，最后用ddH2O 水沖洗3 次。根據(jù)蔓枯病菌的菌落形態(tài)，挑取菌落邊緣菌絲在PDA 上重復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)、純化，最終分離得到蔓枯病菌112 株[3]。對(duì)甲基硫菌靈敏感的蔓枯病菌菌株HC-1 和HC-11，由西南大學(xué)畢朝位饋贈(zèng)。

1.3 抗藥性檢測(cè)

1.3.1 對(duì)甲基硫菌靈的抗性 采用區(qū)分劑量法[13]。將從浙江省5 市分離獲得的112 株田間菌株，在25 ℃培養(yǎng)3 d 后，打取直徑為5 mm 的菌碟，分別接種在含甲基硫菌靈5 和100 μg/mL的PDA 平板上，以含相同體積丙酮但不含藥劑的PDA 平板為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3 次。于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。根據(jù)菌株不同生長(zhǎng)表型定義為：在5 μg/mL 甲基硫菌靈上不能生長(zhǎng)的為甲基硫菌靈敏感 (定義為BenS) 菌株，在100 μg/mL 的甲基硫菌靈上能生長(zhǎng)的為甲基硫菌靈高水平抗性(BenHR) 菌株[13]。按公式 (1) 計(jì)算抗藥性頻率。

式中：FR為抗藥性頻率；NR為抗藥性菌株數(shù)；NT為總菌株數(shù)。

1.3.2 對(duì)啶酰菌胺的抗性 如上將分離獲得的菌株分別接種在含啶酰菌胺10、50 和100 μg/mL[14-15]的PDA 上，以含相同體積丙酮的PDA 平板為對(duì)照，重復(fù)3 次。于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。根據(jù)菌株不同生長(zhǎng)表型定義為：在10 μg/mL 啶酰菌胺上不能生長(zhǎng)的為啶酰菌胺敏感 (BosS) 菌株；在10 μg/mL 的啶酰菌胺上能生長(zhǎng)，但在50 μg/mL 下不能生長(zhǎng)的為啶酰菌胺低水平抗性 (BosLR) 菌株；在50 μg/mL 啶酰菌胺上能生長(zhǎng)，但在100 μg/mL 下不能生長(zhǎng)的為啶酰菌胺中水平抗性 (BosMR) 菌株，在100 μg/mL 啶酰菌胺上能生長(zhǎng)的為啶酰菌胺高水平抗性 (BosHR) 菌株[14-15]。

1.4 抗藥性分子機(jī)制分析方法

1.4.1 對(duì)甲基硫菌靈的抗性機(jī)制 蔓枯病菌的βtubulin基因引物參考劉順濤[16]的方法。引物序列為：CQ59: 5′-TGGTGCTGGTAACAACTG-3′，CQ: 60 5′-GTCCTCGACCTCCTTCAT-3′，由杭州有康生物科技有限公司合成。以提取的西 (甜) 瓜蔓枯病菌的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增β-tubulin的基因序列。β-tubulin基因序列的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃停止反應(yīng)。

1.4.2 對(duì)啶酰菌胺的抗性機(jī)制 蔓枯病菌的SdhB基因引物參考王少秋等[17]的方法。引物序列為：CQ62: 5′-CTTGTCCCTGACATGACACTT-3′，CQ63: 5′-TCCTTGAGCAGTTGAGAATGG-3′，由杭州有康生物科技有限公司合成。以提取的西 (甜) 瓜蔓枯病菌的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增部分SdhB的基因序列。SdhB基因序列的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃停止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 西(甜)瓜蔓枯病菌對(duì)甲基硫菌靈和啶酰菌胺的抗性情況

通過(guò)區(qū)分劑量法檢測(cè)了從浙江省5 地采集的112 株蔓枯病菌對(duì)甲基硫菌靈和啶酰菌胺的抗性。結(jié)果顯示：112 株蔓枯病菌均能在含100 μg/mL 甲基硫菌靈的PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，均為對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生高水平抗性 (BenHR) 的菌株，未檢測(cè)到低水平抗性 (BenLR) 及敏感 (BenS) 菌株，表明供試菌株對(duì)甲基硫菌靈的抗性頻率已達(dá)100%。而對(duì)于啶酰菌胺，在112 株蔓枯病菌中：共有80 株菌株對(duì)啶酰菌胺表現(xiàn)敏感 (BosS)；32 株菌株表現(xiàn)出抗性(BosR)，抗性頻率為28.6%，其中有21 株表現(xiàn)出低水平抗性 (BosLR)，抗藥性頻率為18.8%；有11株表現(xiàn)出高水平抗性 (BosHR)，抗藥性頻率為9.8%；未發(fā)現(xiàn)對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生中水平抗性 (BosMR) 的菌株。

從蔓枯病菌的不同寄主來(lái)看，西瓜和甜瓜上BenHR菌株的頻率均為100%。對(duì)于啶酰菌胺：西瓜上對(duì)其已產(chǎn)生抗性的菌株 (BosR) 的頻率為28.4%，其中包含22.4%的BosLR菌株和6.0%的BosHR菌株；而甜瓜上BosR、BosLR和BosHR頻率分別為28.9%、13.3%和15.6%，BosHR菌株的比例略高于西瓜上的。

2.2 西(甜)瓜蔓枯病菌對(duì)甲基硫菌靈的抗性機(jī)制

通過(guò)引物CQ-59 和CQ-60 對(duì)甲基硫菌靈敏感(2 個(gè)) 和抗性 (2 個(gè)) 菌株的β-tubulin基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為654 bp 的PCR 產(chǎn)物。然后通過(guò)軟件DNAMAN 6.0 對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)主要有6 個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生了改變 (圖1)。其中主要涉及到第354 位堿基由C 變?yōu)門、第447 位堿基由C 變?yōu)門、第534 位堿基由C 變?yōu)門，第663 位堿基由C 變?yōu)門，但它們相應(yīng)的氨基酸沒(méi)有發(fā)生改變，均屬于同義突變。只有第593位堿基由A 變成C 時(shí)，相應(yīng)的第198 位氨基酸發(fā)生了改變 (表1)。通過(guò)軟件DNAMAN 6.0 將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列后，再將其氨基酸進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株的第198 位的氨基酸由Glu (E) 突變?yōu)锳la (A)。

表1 甲基硫菌靈敏感、高抗性菌株部分β-tubulin 基因及氨基酸的突變位點(diǎn)Table 1 The part of β-tubulin gene and amino acids mutation of sensitive and high resistant strains

2.3 西(甜)瓜蔓枯病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性機(jī)制

通過(guò)引物CQ-62 和CQ-63 對(duì)BosS菌株 (2個(gè))、BosLR(2 個(gè)) 和BosHR菌株 (2 個(gè)) 菌株的部分Sdh B基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為367 bp的PCR 產(chǎn)物。將所得序列通過(guò)軟件DNAMAN 6.0 進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第550 位堿基由C 變?yōu)門 (圖2)，相應(yīng)第277 位氨基酸由組氨酸 (His) 突變?yōu)槔野彼?(Tyr) (表2)。通過(guò)軟件DNAMAN 6.0將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列后，再將其進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)抗性菌株的第277 位氨基酸由His (H) 突變成Tyr (Y)。

表2 啶酰菌胺敏感、低抗和高抗菌株部Sdh B 基因及氨基酸的突變位點(diǎn)Table 2 The part of SdhB gene and amino acids mutation of low and high resistant and sensitive strains

3 結(jié)論與討論

浙江省西 (甜) 瓜蔓枯病發(fā)生嚴(yán)重，苯并咪唑類殺菌劑和SDHIs 殺菌劑是西 (甜) 瓜病害防治的常用藥劑，但在浙江省還未見(jiàn)其抗藥性的相關(guān)研究報(bào)道。本研究于2019 年6 從浙江省5 地采集了112 株蔓枯病菌，采用區(qū)分劑量法檢測(cè)了其對(duì)苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈 (Ben) 和SDHIs 殺菌劑啶酰菌胺 (Bos) 的抗性情況。結(jié)果顯示：112 株蔓枯病菌對(duì)供試2 個(gè)殺菌劑的抗藥性頻率分別為100%和28.6%，其中對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生高水平抗性 (BenHR) 的菌株達(dá)到100%，對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生低水平抗性 (BosLR) 和高水平抗性 (BosHR) 的菌株分別為18.8% 和9.8%。在分離自西瓜的蔓枯病菌中，包含22.4%的BosLR和6.0%的BosHR菌株；而在分離自甜瓜的蔓枯病菌中，BosLR和BosHR分別占13.3%和15.6%，兩者抗藥性頻率相近，但甜瓜蔓枯病菌高水平抗性菌株 (BosHR) 的比例略高。已有研究報(bào)道，在中國(guó)重慶、貴州地區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)西瓜蔓枯病菌對(duì)多菌靈的抗性，其中重慶武隆地區(qū)多菌靈的抗性頻率已達(dá)98.5%，但尚未見(jiàn)蔓枯病菌對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生田間抗性的報(bào)道[18]。

劉順濤[16]發(fā)現(xiàn)，蔓枯病菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性的機(jī)制是其β-tubulin 上發(fā)生了E198A 點(diǎn)突變。王少秋[18]報(bào)道，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得的蔓枯病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性突變體的抗性機(jī)制為Sdh B 上H277Y 點(diǎn)突變。本研究結(jié)果顯示：田間BenHR菌株的抗性機(jī)制為β-tubulin 第198 位氨基酸由Glu(E) 突變?yōu)锳la (A)；田間BosHR菌株的抗性機(jī)制是Sdh B 的第277 位氨基酸由His (H) 突變成了Tyr (Y)，但是田間BosLR的抗性機(jī)制尚不清楚。本研究驗(yàn)證了劉順濤的結(jié)論，同時(shí)在王少秋的基礎(chǔ)上明確了田間BosHR的蔓枯病菌是由于Sdh B上H277Y 突變導(dǎo)致的。

Stevenson 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜蔓枯病菌田間BosR菌株在Sdh B 亞基第277 位上的氨基酸由組氨酸 (H) 突變?yōu)槔野彼?(Y)。Avenot 等[20]發(fā)現(xiàn)，開(kāi)心果晚疫病菌Alternaria alternata的BosHR菌株Sdh B 序列的277 位上的組氨酸突變?yōu)榱死野彼峄蚓彼幔换矢\(yùn)紅[21]發(fā)現(xiàn)，浙江省草莓灰霉病菌Botrytis cinerea對(duì)啶酰菌胺抗性菌株 (BosR) 的抗性分子機(jī)制為Sdh B 的S244T 突變和H277T 或H277R 雙重突變。除了Sdh B 亞基發(fā)生突變外，SDHIs 抗性問(wèn)題的產(chǎn)生還可能與Sdh C 和Sdh D亞基上突變有關(guān)。2008 年，Ishii 等[22]報(bào)道，日本田間檢測(cè)到的黃瓜褐斑病菌Corynesporasp. 的BosMR菌株的突變位點(diǎn)有Sdh C (S73P) 和Sdh D(S89P, G109V)。2019 年，Pearce 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在除蟲(chóng)菊褐色斑點(diǎn)病菌Didymella tanaceti的BosMR菌株中，突變位點(diǎn)有Sdh B (I279V)、Sdh C(H134Q) 和Sdh D (D112E)。除靶標(biāo)位點(diǎn)基因發(fā)生突變外，還有研究認(rèn)為靶標(biāo)基因表達(dá)的上升或下調(diào)可能導(dǎo)致指狀青霉菌Penicillium digitatum對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗性[24]。此外，外排系統(tǒng)中的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或MSF 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過(guò)量表達(dá)也會(huì)使灰霉病菌對(duì)包括啶酰菌胺在內(nèi)的多種SDHIs 殺菌劑產(chǎn)生低到中等水平抗性[25-26]。由于本研究只擴(kuò)增了Sdh B基因的部分片段，BosLR菌株產(chǎn)生抗性的原因可能是在未擴(kuò)增的片段產(chǎn)生了突變位點(diǎn)，也可能是靶標(biāo)基因的表達(dá)上升或下調(diào)。此外，外排機(jī)制或許也可能夠與本研究中對(duì)啶酰菌胺表現(xiàn)出低水平抗性有關(guān)，但具體抗藥性機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明，浙江省西(甜)瓜蔓枯病菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗性已十分嚴(yán)重，應(yīng)停止該類藥劑在西(甜) 瓜病害防治中的田間應(yīng)用。大多數(shù)菌株對(duì)啶酰菌胺表現(xiàn)敏感，但在一些地區(qū)存在高抗菌株，應(yīng)注意科學(xué)使用殺菌劑，并加強(qiáng)抗藥性監(jiān)測(cè)。