斜紋夜蛾SlGSTO2 對擬除蟲菊酯類和有機磷類殺蟲劑體外代謝及其抗氧化活性

何承帥, 謝蘭芬, 徐 莉, 段雪蓮, 任青青,郭佳佳, 吳艷兵, 李冬植

(河南科技學院 資源與環境學院, 河南 新鄉453003)

斜紋夜蛾Spodoptera litura(Fabricius) 是一種世界范圍內分布的暴食性農業害蟲，具有繁殖能力強、寄主植物種類多、世代交替、易暴發成災等特點，對農業生產和城市綠化造成嚴重的危害。根據斜紋夜蛾的發生特點，目前對其防治仍以施用化學藥劑為主，其中，擬除蟲菊酯類 (以下簡稱菊酯類) 和有機磷類殺蟲劑因廣譜高效，且價格低廉，被廣泛用于斜紋夜蛾等鱗翅目害蟲的防治，但由于存在頻繁使用，加之施用時間不科學、施用劑量不準確、操作不規范等問題，導致斜紋夜蛾對菊酯類和有機磷類殺蟲劑的抗性問題突出[1-3]，致使藥劑防效下降甚至完全失效，造成嚴重的經濟損失。對斜紋夜蛾的抗性機制進行研究是合理制定田間綜合防治措施的基礎，對于斜紋夜蛾抗性治理具有重要意義。

谷胱甘肽S-轉移酶 (glutathioneS-transferases，GSTs) 是生物體中重要的解毒酶系，其參與的代謝作用增強是害蟲產生抗性的重要原因[4-5]。昆蟲中的GSTs 包含微粒體GSTs (microsomal GSTs) 和胞質GSTs (cytosolic GSTs) ，胞質GSTs 可分為Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta 和Zeta 6個主要家族以及1 個未分類家族(unclassified)[6-8]。GSTs 主要通過催化還原型谷胱甘肽 (reduced glutathione，GSH) 和殺蟲劑的軛合參與對殺蟲劑的解毒。例如，東方果實蠅Bactrocera dorsalis中的BdGSTE2和BdGSTE4基因在抗馬拉硫磷種群中顯著過量表達，研究發現其重組蛋白對馬拉硫磷有催化軛合作用，用RNAi 技術將這兩個基因分別沉默能夠增加東方果實蠅對馬拉硫磷的敏感性，表明這兩個基因參與了東方果實蠅對馬拉硫磷的抗性[9]。Meng 等[10]報道了東方果實蠅中BdGSTd1和BdGSTd10基因也具有類似的功能活性，可介導其對馬拉硫磷抗性的產生。同時GSTs還具有與殺蟲劑直接結合進行區域化隔離的能力以及抗氧化活性[11-12]。Kostaropoulos 等[13]利用熒光結合試驗和色譜分析法研究黃粉蟲Tenebrio molitor對氯氰菊酯的抗性機制時發現，氯氰菊酯可與黃粉蟲的GSTs 活性中心結合。Wilding 等[14]發現岡比亞按蚊Anopheles gambiae和阿拉伯按蚊A. arabiensis抗性種群中過量表達的GSTE4基因對菊酯類藥劑沒有直接代謝作用，但可以通過與藥劑的結合起隔離貯存的作用。

斜紋夜蛾中已鑒定出20 個Epsilon、5 個Delta、7 個Sigma、2 個Zeta、3 個Omega、1 個Theta 和4 個Unclassfied 家族的GSTs 基因[15]，是已知GSTs 數量較多的害蟲[16-17]，其中對Epsilon家族基因在殺蟲劑抗性中的研究較多。如SlGSTE1 重組蛋白具有與多種殺蟲劑結合的活性和抗氧化活性[18]，RNAi 介導的該基因沉默可以顯著增加斜紋夜蛾對氰戊菊酯的敏感性[19]。SlGSTE2基因可被甲萘威、DDT、溴氰菊酯、蟲酰肼和Bt 誘導表達，異源表達發現，DDT 和溴氰菊酯可以顯著抑制SlGSTE2 重組蛋白對模式底物1-氯-2,4-二硝基苯 (1-chloro-2,4-dinitrobenzene, CDNB)的酶活性[20]。SlGSTE7 和SlGSTE20 重組蛋白對底物CDNB 的活性可被二嗪磷、蟲威、氯菊酯和蟲螨腈顯著抑制，尤其是二嗪磷[21]。也有文獻報道，GSTs Omega 家族基因在昆蟲的解毒代謝中發揮重要作用，如將抗茚蟲威的小菜蛾Plutella xylostella的GSTO4基因沉默，可以顯著增加茚蟲威對其的毒力[22]。此外，GSTs Omega 家族基因在醫學上還有減少氧化損傷和阻止DNA 損傷的重要作用[23]，而目前尚未見對斜紋夜蛾中該家族基因的研究報道。

前期通過轉錄組測序 (RNA-Seq) 和實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 分析發現，SlGSTO2基因在抗菊酯類斜紋夜蛾種群的3 齡幼蟲中顯著上調表達[19]，為了探究該基因在菊酯類和有機磷類殺蟲劑抗性中的作用，本文通過原核表達測定了其對這兩類殺蟲劑的代謝活性及其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本研究以室內多代飼養的相對敏感種群即廣西種群 (GX) 斜紋夜蛾作為供試昆蟲，試蟲采集信息和飼養條件參照Xu 等[19]報道。

1.2 藥劑、試劑與儀器

93.4% 氰戊菊酯 (fenvalerate) 原藥， 購自江蘇常州常隆化工有限公司；95.0% 高效氯氰菊酯 (betacypermethrin) 原藥 、98.4% 三氟氯氰菊酯(cyhalothrin) 原藥 、91.0% 辛硫磷 (phoxim) 原藥和95.0% 毒死蜱 (chlorpyrifos) 原藥，均購自北京華戎凱威植保生物科技有限公司。CDNB、GSH、99% 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、99.5% 甘氨酸(glycine)、丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(mcrylamides/bis-acrylamide, 質量比29 : 1，生化級) 和過氧化氫異丙苯 (cumene hydroperoxide, CHP) ，均購自百靈威科技(北京)有限公司；RNA 提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ，均購自寶生物工程 (大連) 有限公司；FastQuant RT Kit、pLB 零背景快速克隆試劑盒、大腸桿菌Escherichia coliBL21 (DE3) 感受態細胞、異丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside, IPTG) 、卡那霉素 (kanamycin，Kan)和Bradford 蛋白質定量試劑盒，均購自天根生化科技 (北京) 有限公司；HisPurTMNi-NTA Purification Kit 蛋白純化試劑盒、ZebaTMSpin Desalting Columns 旋轉脫鹽柱與乙腈 (HPLC 級) ，均購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司；超聲波細胞破碎儀VCX2500 購自美國Sonics & Materials公司；Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS 超高效液相色譜 (Ultra-Performance Liquid Chromatography,UPLC) 購自美國Waters 公司。

1.3 表達載體的構建

用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 提取斜紋夜蛾3 齡幼蟲的總RNA，參照Fast-Quant RT Kit 的說明書對總RNA 進行反轉錄和cDNA 第一鏈合成。以cDNA 為模板，以分別在5′ 端引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點的SlGSTO2-F1 和SlGSTO2-R1 為引物對 (引物設計如表1 所示) ，擴增SlGSTO2基因的cDNA 全長，并連接到pLB 載體中，用限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ將其和表達載體pET-26b(+)進行雙酶切，將酶切后的產物進行連接，從而構建重組質粒pET-26b(+)/SlGSTO2，其結構如圖1 所示。

表1 SlGSTO2 基因cDNA 全長擴增的引物對Table 1 Primer pairs used in cDNA full length amplification of SlGSTO2 gene

1.4 重組蛋白的分離純化和電泳

采用熱擊法將重組質粒轉化到大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) 中。將轉化成功的大腸桿菌在LB 液體培養基中振蕩培養 (37 °C，160 r/min) 至OD600= 0.6，加入IPTG 使其終濃度為1.0 mmol/L ，誘導重組蛋白SlGSTO2 在大腸桿菌中表達。將其在37 °C、160 r/min 下振蕩誘導培養3 h，隨后在4 °C、10 000g下離心10 min，棄去上清液，加入適量磷酸緩沖液 (PBS，20 mmol/L，pH 7.0) 以重懸菌體，用超聲波細胞破碎儀超聲處理10 min (工作10 s，暫停5 s) 使細胞裂解，經20 000g離心30 min，收集上清液即為重組蛋白SlGSTO2 粗提液。采用HisPurTMNi-NTA Purification Kit 進一步純化重組蛋白，用ZebaTMSpin Desalting Columns進行去鹽。以上所有步驟均在4 °C 或冰上進行。

采用Bradford 蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度，用PBS 將上述純化重組蛋白稀釋至1 mg/mL。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDSPAGE，12.5%) 電泳鑒定重組蛋白是否成功表達。

1.5 SlGSTO2 重組蛋白離體代謝活性測定

采用超高效液相色譜測定SlGSTO2 對菊酯類和有機磷類殺蟲劑的體外代謝活性。參照Riveron等[7]的方法并稍作修改。將180 μL 純化的重組蛋白 (1 mg/mL) 加入到250 μL 的PBS (0.1 mol/L，pH 6.8) 中混勻，預熱后依次加入20 μL 500 mg/L的菊酯類或有機磷類殺蟲劑 (使反應體系中殺蟲劑的終濃度為20 mg/L) 和50 μL GSH (100 μmol/mL，pH 7.0，現配現用) ，在37 °C 恒溫水浴鍋中孵育3 h。在反應體系中加入等體積的乙腈，再加入氯化鈉使其飽和，振蕩離心，上清液過0.22 μm 濾膜，用于UPLC 檢測。儀器檢測條件為流動相V(乙腈) :V(水) = 80 : 20，流速0.4 mL/min，進樣體積5 μL，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm (2.1 mm × 100 mm) ，柱壓48.9 MPa。高效氯氰菊酯是一種手性殺蟲劑，在該檢測條件下可分離為順式氯氰菊酯 (alpha-cypermethrin) 和反式氯氰菊酯 (theta-cypermethrin) 。用光電二級陣列管檢測器(photo-diode array，PDA)分別在220、220、230、280 和290 nm 處對氰戊菊酯、高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、辛硫磷和毒死蜱進行定量，以PBS 為對照，每個處理重復4 次。

1.6 表達菌株代謝活性測定

用轉化SlGSTO2 的大腸桿菌測定其對菊酯類和有機磷類殺蟲劑的代謝活性。從LB 固體培養基中挑取SlGSTO2 的單克隆菌落，在含有50 mg/L Kan 的LB 液體培養基 (25 mL) 中振蕩培養24 h，并將其稀釋為OD600= 1 的種子液低溫保存。取200 mL 錐形瓶，加入50 mL LB 液體培養基 (含50 mg/L Kan，50 mg/L有機磷類或者25 mg/L 菊酯類殺蟲劑) ，接入2 mL 種子液 (OD600= 1) 。將其在37 °C、120 r/min下振蕩培養6 h 后，加入IPTG 誘導目的蛋白表達，分別于0、24、48、72、96 h 取樣，樣品的提取和儀器檢測條件同1.5 節。以LB 液體培養基和轉化了pET-26b(+)空載體的大腸桿菌為對照，每個處理重復4 次。

1.7 抑菌圈試驗

以CHP 作為過氧化物源，采用抑菌圈試驗測定SlGSTO2 是否具有抗氧化活性，具體方法參考Labade 等[24]。取0.2 mL OD600= 1 的種子液均勻涂布于LB 固體培養基 (含50 mg/L Kan 和1 mmol/L IPTG) 上，在37 ℃下培養1 h 后加入浸有不同濃度CHP (0、50、100、200、300 mmol/L，用丙酮配制) 的圓形濾紙 (直徑5 mm) ，在37 °C 下培養24 h，測量抑菌圈直徑。以只含表達載體pET-26b(+)的菌液為對照，如若處理組抑菌圈直徑小于對照組，則表明SlGSTO2 具有抗氧化活性。每個濃度重復3 次，試驗重復2 次。

1.8 數據分析

試驗數據均采用SPSS 16.0 進行統計學分析，SlGSTO2 的體外代謝活性和抑菌圈試驗均采用Student’st-test 進行顯著性分析，SlGSTO2 的表達菌株代謝活性采用單因素方差的Duncan’s 分析法。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白SlGSTO2 的SDS-PAGE

用SDS-PAGE 對SlGSTO2 的粗酶液和純化蛋白進行電泳，結果如圖2 所示。與轉化空載體pET-26b(+)的大腸桿菌粗酶液 (Lane 1) 或含重組蛋白SlGSTO2 的大腸桿菌粗酶液 (Lane 2) 相比，IPTG 誘導的含重組蛋白SlGSTO2 大腸桿菌粗酶液 (Lane 3) 及其純化后的重組蛋白SlGSTO2 (Lane 4) 在26 kDa 與33 kDa 之間有一條明顯的條帶，與SlGSTO2 的理論分子質量32.5 kDa (Compute pI/Mw，https://web.expasy.org/compute_pi/) 相符。

2.2 重組蛋白SlGSTO2 對菊酯類和有機磷類殺蟲劑的體外代謝

將純化的重組蛋白SlGSTO2 與菊酯類和有機磷類殺蟲劑共孵育3 h 后，用UPLC 測定殺蟲劑的殘留量，以測定其體外代謝活性。結果表明，與PBS 相比，純化后的重組蛋白SlGSTO2 僅顯著降低了三氟氯氰菊酯的殘留量，代謝率為5.2%，而對氰戊菊酯、順式氯氰菊酯、反式氯氰菊酯、辛硫磷和毒死蜱等殺蟲劑的殘留量無顯著影響(表2) 。

表2 純化后的重組蛋白SlGSTO2 對殺蟲劑的體外代謝活性Table 2 The metabolic activity of purified recombinant protein SlGSTO2 to insecticides in vitro

2.3 表達菌株對菊酯類和有機磷類殺蟲劑的代謝

將菊酯類或有機磷類殺蟲劑和含pET-26b(+)/SlGSTO2 的大腸桿菌種子液共同孵育，用UPLC測定殺蟲劑的殘留量。結果表明，與pET-26b(+)和LB 液體培養基處理后的殘留量相比，轉化了pET-26b(+)/SlGSTO2 的大腸桿菌與殺蟲劑共同孵育后，所測殺蟲劑的殘留量均無顯著變化 (圖3) 。

2.4 SlGSTO2 的抗氧化活性

采用CHP 作為過氧化物脅迫源，測定了轉化pET-26b(+)/SlGSTO2 的大腸桿菌的抗氧化活性。結果表明，隨著CHP 濃度的升高，涂布轉化pET-26b(+)和pET-26b(+)/SlGSTO2 大腸桿菌的LB 平板中濾紙片抑菌圈直徑均逐漸增大 (圖4A 和4B) 。但是與涂布轉化pET-26b(+)的大腸桿菌相比，涂布轉化pET-26b(+)/SlGSTO2 大腸桿菌的LB 平板的濾紙片抑菌圈直徑顯著減小 (圖4A) ，當CHP濃度分別為50、100、200 和300 mmol/L 時，其抑菌圈直徑較涂布pET-26b(+) 的分別減小了38.7%、47.1%、50.7%和42.6% (圖4A) 。

3 討論與結論

目前針對GSTs 基因在昆蟲抗性中的功能研究多集中在Delta 和Epsilon 家族，對Omega 家族的GSTs 基因功能研究相對較少。本課題組前期研究發現，在田間采集的4 個抗菊酯類殺蟲劑的斜紋夜蛾種群中，SlGSTO2基因均呈現顯著的過量表達[19]，為了研究該基因和殺蟲劑抗性的關系，本文構建了大腸桿菌pET-26b(+)/SlGSTO2 表達載體，并對其代謝活性和抗氧化活性進行了研究。

一般認為，在抗性種群中上調表達的基因預示著其可能參與了對殺蟲劑的抗性，但二者之間并無確定的關聯，仍需進行進一步的功能驗證。本研究結果表明，將斜紋夜蛾SlGSTO2基因在大腸桿菌中成功表達后，并沒有檢測到其對氰戊菊酯和高效氯氰菊酯等殺蟲劑的代謝活性，僅對三氟氯氰菊酯有微弱的體外代謝，代謝率為5.2%。GSTs 被廣泛報道可以直接代謝有機磷類殺蟲劑[9-10,25-26]，本研究發現，SlGSTO2 對常用的有機磷類殺蟲劑辛硫磷和毒死蜱均無代謝作用。目前，在其他昆蟲中也未見有Omega 家族GSTs 直接參與殺蟲劑代謝的研究報道。家蠶Bombyx mori中腸中的GSTO2基因可以顯著地被氰戊菊酯誘導表達，推測其可能與家蠶對氰戊菊酯的耐受性有一定關系[27]。

GSTs 廣泛參與菊酯類殺蟲劑抗性的形成[28]，盡管尚未能檢測到GSTs 催化菊酯類殺蟲劑與GSH反應的軛合產物[29]，但GSTs 可以通過清除過氧化物或直接與菊酯類殺蟲劑結合進行區域化隔離等方式介導抗性的產生[30-31]。本研究通過抑菌圈試驗結果表明，表達pET-26b(+)/SlGSTO2 的大腸桿菌可以顯著縮小由CHP 處理引起的抑菌圈直徑，說明其具有顯著的抗氧化活性。Yamamoto 等[32]的研究結果表明，家蠶Omega 家族的GSTs 基因可以被多種環境脅迫誘導表達，表明該家族基因可能增加了家蠶對環境脅迫的耐受性。中華蜜蜂Apis cerana cerana中AccGSTO2基因可以被紫外線、過氧化氫和殺蟲劑等非生物脅迫誘導表達，純化的重組蛋白AccGSTO2 具有依賴谷胱甘肽的脫氫抗壞血酸還原酶和抗氧化物酶活性；將該基因沉默，可以顯著降低過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽還原酶活性，增加過氧化氫、丙二醛和羰基含量，說明該基因可以通過抗氧化活性減少氧化損傷[33-34]。在禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi中，RpGSTO1 重組蛋白可以消除CHP 誘導的氧化損傷，具有顯著的抗氧化活性[35-36]。

大量國內外研究表明，殺蟲劑能誘導昆蟲引起氧化應激導致脂質過氧化反應[32,37-39]，如使家蠶直接接觸二嗪磷、氯菊酯和吡蟲啉，可明顯增加蟲體內過氧化氫含量[32]。Vontas 等[29,40]對褐飛虱Nilaparvata lugens的研究發現，用菊酯類藥劑汰選得到的抗性種群GSTs 酶活性升高，但純化的GSTs 蛋白對菊酯類藥劑或其初級代謝產物均沒有代謝活性；進一步研究發現，抗性種群中的NlGST1-1 活性提升可以有效地清除因菊酯類藥劑暴露引起的過氧化物，減少脂質過氧化。據李周直等[41]報道，用溴氰菊酯處理菜粉蝶Pieris rapae10 min 后，該蟲體內超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、CAT 和過氧化物酶 (peroxidase，POD)的活性均高于對照；而處理邊綠刺蛾Parasa consocia和褐刺蛾Thosea pastornata后，SOD 和CAT 活性隨蟲體中毒程度加重而不斷上升，接近死亡時又急劇下降，這表明在逆境下昆蟲可通過提高體內抗氧化活性來適應對外界毒害的影響。本研究發現，斜紋夜蛾SlGSTO2 僅對三氟氯氰菊酯有微弱的體外代謝活性，同時還具有明顯的抗氧化活性，推測其可通過抗氧化活性緩解殺蟲劑對害蟲造成的氧化損傷而參與抗性形成。