嘧菌酯與三種外源硒對不同生命階段斑馬魚的聯合毒性

郭志芯, 毛連綱, 張 蘭, 張燕寧, 朱麗珍, 蔣紅云

(中國農業科學院 植物保護研究所，農業農村部農產品質量安全生物性危害因子(植物源)控制重點實驗室，北京 100193)

嘧菌酯是中國水稻上防治紋枯病和稻瘟病的常用殺菌劑，由帝國化學工業公司 (ICI) 開發，是中國目前登記條目最多的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[1]。其作用機理是抑制線粒體呼吸產生三磷酸腺苷 (ATP) ，從而抑制病原菌的能量合成[2]。嘧菌酯已被列為殘留污染物4 類等級 (根據生物累積性和持久性劃分為優勢、頻發、偶然及稀少) 中的頻發等級[3]，其對環境生物尤其是水生生物表現出高毒和遺傳毒性，歐洲食品安全局 (EFSA) 評估其對水生生物劇毒[4]。斑馬魚暴露于1 500 mg/L 的嘧菌酯中會分別在24、48、72 和96 h 出現形態異常，如尾部畸形、心包水腫、卵黃囊水腫和脊柱彎曲等，并影響其線粒體功能，出現氧化應激、細胞凋亡和先天免疫反應等，甚至影響其生殖功能[5-9]。

目前，功能農業作為中國現代農業轉型升級的重要戰略方向，受到越來越多的關注。硒(Se)是人體和動物體必需微量元素，其特殊作用導致富硒農產品得到快速發展[10]。生產中利用硒肥和硒飼料是獲得富硒農產品的主要技術手段，但硒也是一把“雙刃劍”，不同形態外源硒大量應用于生產富硒農產品，在滿足人畜正常補硒需求的同時，也對生態環境及人體健康形成潛在威脅。硒具有蓄積、傳遞和富集特性，超出營養劑量需求的硒對水生生物如斑馬魚Danio rerio表現出致畸、生長發育毒性及種群繁衍毒性效應[11-12]。日本青鳉Oryzias latipes暴露于水相亞硒酸鹽或納米硒后，其肝臟中的超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性顯著降低[13]；大鱗裂尾魚Pogonichthys macrolepidotus在攝食含有富硒酵母的食物后 (硒質量分數57.6 mg/kg)，肝臟出現胞質蛋白油滴、脂肪泡萎縮變性等現象[14]。

嘧菌酯在水稻田施用時期為紋枯病發病初期(即水稻分蘗末期)[15]和稻瘟病發病時期 (即水稻整個生育時期，其中以4 葉期至分蘗期、抽穗期最易感病)[16]；而硒肥多集中在水稻齊穗期和抽穗期施用[17]。硒在環境中的生物吸收轉化利用率很低[18]，未被吸收的硒在土壤和水體環境中日積月累，有可能與嘧菌酯等農藥在稻田水生生態系統中形成復合污染。目前，有關嘧菌酯或硒對水生生物的單一毒性效應研究較多[5-9,11-14]，但兩者的聯合毒性效應尚未見報道。開展嘧菌酯與不同類型硒的二元聯合毒性效應研究，可以為硒與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的科學安全應用提供指導，從而促進富硒產業和農作物病害防治的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 供試生物與飼養條件

1.1.1 斑馬魚成魚 斑馬魚Danio rerio成魚購于北京高峰水族館，體長3.00～4.00 cm，體重0.15～0.30 g。在試驗室馴養15 d 以上，馴養用水經曝氣去氯處理 (簡稱曝氧水)，pH 值為7.0～8.5，水中溶氧量飽和度大于80%，水溫(27±1) ℃。保持光照/黑暗(14 h/10 h)循環。馴養期間每天喂食適量魚飼料，至試驗開始前24 h 為止。馴養期間正常死亡率保持在5%以下。

1.1.2 斑馬魚親魚 采用野生型AB 品系，購于國家斑馬魚資源中心 (武漢)，在本實驗室進行飼養繁殖，試驗過程嚴格遵守動物倫理學操作規范。斑馬魚養殖條件為：獨立養殖系統 (北京愛生科技發展有限公司) 飼養繁殖斑馬魚，保持光照/黑暗 (14 h/10 h) 循環，室溫 (28.0±0.5) ℃；水循環系統使用處理后的自來水 (簡稱重組水)，即經過除雜、除氯、凈化和紫外消毒，添加氯化鈉和碳酸氫鈉，保持電導率為 (500±50) μS/cm，水溫(26±1) ℃，pH 值為7.0～7.5；廢物處理系統自動過濾魚的糞便和剩余魚食，廢水排出后自動補充新鮮養魚水。每日喂食豐年蝦3 次。

1.1.3 試驗用胚胎 于試驗開始前一天下午，挑選健康、發育一致的成年斑馬魚親魚 (10 月齡)，按照雌雄比例1 : 1 轉移到配魚盒內，用隔板隔開，配魚盒環境條件與斑馬魚親魚養殖條件一致。次日光照開始后，抽隔板，收集受精2 h 的胚胎用于胚胎毒性暴露試驗。

1.1.4 試驗用仔魚 首先收集受精2 h 的胚胎 (方法同1.1.3 節)，正常孵化后，挑選孵化后72 h 的正常仔魚用于仔魚毒性暴露試驗。

1.2 儀器與試劑

Nano-ZS 型激光粒度儀 (英國馬爾文公司)；SG68 多參數測試儀 (梅特勒-托利多儀器有限公司)；YD300 便攜式水質硬度儀 (上海三信儀表廠)；24 孔細胞培養板 (美國康寧公司)；BX63 奧林巴斯生物顯微鏡 (奧林巴斯株式會社)；TG16-WS 型臺式高速離心機 (長沙湘儀離心機儀器有限公司)；Agilent 6 470 高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀 (安捷倫科技有限公司)；AVIO200 型電感耦合等離子體發射光譜儀 (珀金埃爾默企業管理(上海) 有限公司)。

98%嘧菌酯 (azoxystrobin) 原藥，購于連云港市金囤農化有限公司；亞硒酸鈉 (sodium selenite)，純度99%，購于AMRESCO, LLC；硒代蛋氨酸(selenomethionine)，純度98%，購于百靈威科技有限公司；1 500 mg/L 的納米硒 (nano-selenium)母液，由中國農業大學理學院農藥創新研究中心潘燦平教授課題組提供。

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) (天津博納艾杰爾科技有限公司)。

1.3 藥劑暴露試驗

1.3.1 單一藥劑暴露試驗

1.3.1.1 對斑馬魚成魚的毒性試驗 參照化學農藥環境安全評價試驗準則[19]和OECD 203[20]設計試驗。用適量丙酮配制1 000 mg/L 的嘧菌酯母液，用重組水分別配制10 000 mg/L (mg 指硒Se 元素的質量，通過硒元素的相對原子質量和亞硒酸鈉的相對分子質量將亞硒酸鈉的質量濃度換算得到，下同) 的亞硒酸鈉母液、1 000 mg/L 的硒代蛋氨酸母液和1 000 mg/L 的納米硒母液。將隨機挑選的斑馬魚成魚分別暴露于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的嘧菌酯系列溶液，1.55、3.10、6.20、12.38、24.76 mg/L 的亞硒酸鈉系列溶液，1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mg/L 的硒代蛋氨酸系列溶液和0.23、0.35、0.52、0.78、1.17、1.76、2.63 mg/L 的納米硒系列溶液中。暴露試驗在5 L 魚缸中進行，每個魚缸中盛有藥液3 L 和10 條成魚作為一個重復。同時設空白對照 (重組水)和溶劑對照 (體積分數0.01%的丙酮水溶液)，每處理3 次重復。分別觀察處理24、48、72 和96 h 斑馬魚的死亡數和中毒癥狀，及時清理死魚。判斷死魚的標準是用玻璃棒輕觸魚的尾部無可見運動。每24 h 更換全部藥液。

1.3.1.2 對斑馬魚仔魚的毒性試驗 參考Giari等[21]的方法，挑選孵化后72 h 的正常仔魚供試。用適量丙酮配制60 mg/L 的嘧菌酯母液，用重組水分別配制150 mg/L 的亞硒酸鈉母液、硒代蛋氨酸母液和納米硒母液。將仔魚分別暴露于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的嘧菌酯系列溶液，0.51、0.77、1.16、1.73、2.60 mg/L 的亞硒酸鈉系列溶液，0.44、0.57、0.74、1.04、1.45 mg/L 的硒代蛋氨酸系列溶液和0.52、0.78、1.17、1.76、2.63、3.95 mg/L 的納米硒系列溶液中。試驗在200 mL 燒杯中進行，每個燒杯中盛有藥液100 mL 和10 條仔魚作為一個重復。同時設空白對照(重組水)和溶劑對照 (體積分數0.01%的丙酮水溶液)，每處理3 次重復。分別觀察24、48、72 和96 h 的死亡數和中毒癥狀，以顯微鏡觀察無可見心跳作為判斷仔魚死亡的標準，及時清理死魚。每24 h 更換80%藥液。

1.3.1.3 對斑馬魚胚胎的毒性試驗 參照OECD 210[22]和Fraysse 等[23]的方法進行。母液配制同上述仔魚試驗。將斑馬魚胚胎分別暴露于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的嘧菌酯系列溶液，1.31、1.98、2.96、4.44、6.67、10.0 mg/L 的亞硒酸鈉系列溶液，0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mg/L的硒代蛋氨酸系列溶液和1.76、2.63、3.95、5.93、8.89、13.33 mg/L 的納米硒系列溶液中。將胚胎轉移到24 孔板中，每板使用20 個孔，每孔含有2 mL試驗藥液和1 枚受精卵。1 張板為1 個重復，每處理3 次重復。同時設空白對照 (重組水) 和溶劑對照 (體積分數0.01%的丙酮水溶液)。藥液每24 h更換一次。將24 孔板轉移到恒溫培養箱中于 (26±1) ℃下培養，觀察24、48、72 和96 h 的死亡數及中毒癥狀，期間及時清理死亡的卵或幼魚，并記錄死亡數。胚胎死亡的判定標準為是否出現乳白色凝結或發育停滯，幼魚無心跳即判定為死亡。胚胎觀察以及圖像采集使用奧林巴斯生物顯微鏡。

1.3.2 混合藥劑暴露試驗 將嘧菌酯分別和亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸及納米硒兩兩二元混合進行聯合毒性試驗。以單一藥劑對斑馬魚成魚、仔魚和胚胎的96 h-LC50值作為各自的毒性單位，采用等毒性配比的二元混合體系設置系列濃度梯度，成魚分別暴露于嘧菌酯 + 亞硒酸鈉系列溶液、嘧菌酯 + 硒代蛋氨酸系列溶液以及嘧菌酯 + 納米硒系列溶液 (具體質量濃度設置見表1)；仔魚分別暴露于嘧菌酯 + 亞硒酸鈉系列溶液、嘧菌酯 + 硒代蛋氨酸系列溶液以及嘧菌酯 + 納米硒系列溶液 (具體質量濃度設置見表1)；胚胎分別暴露于嘧菌酯 +亞硒酸鈉系列溶液、嘧菌酯 + 硒代蛋氨酸系列溶液以及嘧菌酯 + 納米硒系列溶液 (具體濃度設置見下表1)；同時設空白對照 (重組水) 和溶劑對照(體積分數0.01%的丙酮水溶液)，每個處理3 次重復。試驗方法同上。

表1 二元混劑對斑馬魚不同生命階段的急性毒性試驗質量濃度設置Table 1 The concentrations set in joint acute toxicity test of binary mixtures on adult zebrafish (D. rerio)during different life stages

1.4 供試藥劑含量測定

1.4.1 混劑水樣中嘧菌酯含量測定

分析條件：采用超高效液相色譜-質譜聯用(UPLC-MS/MS) 法檢測，ACQUITYUP LC BEH C181.7 μm 色譜柱，采用梯度洗脫，柱溫30℃，進樣體積5 μL。質譜采用ESI (電噴霧離子源) 正源多重反應監測 (MRM) 模式，母離子 (m/z) 是403.9，子離子 (m/z) 為343.9 和271.9。離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流量50 L/h。

溶劑標準曲線繪制：以乙腈為溶劑將嘧菌酯標準品配制成質量濃度為150 mg/L 的標準儲備液，再分別稀釋成0.006、0.03、0.15、0.6、3 mg/L的系列標準工作溶液。在設定的條件下進樣分析，以嘧菌酯質量濃度為橫坐標，檢出峰面積為縱坐標進行線性回歸。

基質匹配標準曲線繪制：分別吸取3 mL 重組水于10 mL 離心管中，加入嘧菌酯標準儲備液，使其質量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.5、1、3 mg/L，加入3 mL 乙腈，振蕩后加入1.5 g 氯化鈉，振蕩后離心。取1 mL 上層液體過0.22 μm 有機濾膜于進樣瓶中，待測。每個濃度重復3 次。在設定的條件下進樣分析，以嘧菌酯質量濃度為橫坐標，檢出峰面積為縱坐標進行線性回歸。

添加回收試驗：分別吸取3 mL 重組水于10 mL 離心管中，加入嘧菌酯標準儲備液，使其質量濃度分別為0.05、0.5、5 mg/L，樣品處理方法同上述基質匹配標準曲線繪制。每個濃度重復5 次，同時設置基質空白組。

混劑水樣中嘧菌酯含量測定：對試驗初始濃度 (0 h) 及換藥液前濃度 (24 h) 進行實測分析。因成魚攝食量和活動量較仔魚和胚胎更大，對藥液中藥物含量的穩定性影響更大，本文僅選取成魚暴露藥劑進行實測分析。每個重復中分別取3 mL不同組的試液于10 mL 離心管中，操作方法同上。

1.4.2 混劑水樣中總硒含量測定 按照中國國家標準GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體發射光譜法 (ICP-OES)[24]對試驗初始濃度 (0 h) 及換藥液前濃度 (24 h) 的總硒含量進行實測分析。

具體操作為：各混劑水樣采集后采用濕式消解法消解，取定容后樣品過0.45 μm 水系微孔濾膜，待測。AVIO200 型電感耦合等離子體發射光譜儀分析條件：觀測方式垂直觀測，功率1 300 W，等離子氣流量12 L/min，輔助氣流量0.2 L/min，霧化氣氣體流量0.6 L/min，分析泵速1.5 mL/min。測定硒元素采用的分析譜線波長為196.026 nm。

1.5 聯合毒性評價方法

混合污染物的聯合毒性采用以下3 種方法進行評定[25]。

第1 種方法，加和指數 (Additional Index, AI)法[26]。采用公式為S=Am/A1+Bm/B1+···。式中：S為生物毒性相加作用之和；A1、B1分別為A、B 等毒物的毒性 (LC50值) ；Am、Bm為混合物毒性中各毒物的毒性 (LC50值) 。當S≤1 時，AI=1/S?1；當S>1 時，AI=1.0?S。用AI 評價農藥的聯合效應：AI>0 時為協同作用，AI<0 時為拮抗作用，AI=0 時為相加作用。

2 結果與分析

2.1 納米硒樣品表征

采用Nano-ZS 型激光粒度儀對試驗用納米硒溶液進行表征后發現，硒納米粒子粒度分布均勻，強度分布呈正態，平均粒徑約為150 nm (圖1)。

2.2 混劑中各藥劑的濃度分析

2.2.1 嘧菌酯濃度實測分析方法有效性 嘧菌酯溶劑標準曲線檢測結果表明：在0.006～3 mg/L 范圍內，嘧菌酯質量濃度與對應的峰面積呈良好的線性關系，其線性回歸方程為y=192.59x+ 49 948.96(R2=0.995)。基質標準曲線檢測結果表明：在0.01～3 mg/L 范圍內，嘧菌酯質量濃度與對應的峰面積間呈良好的線性關系，其線性回歸方程為y=30.27x+ 2 321.49 (R2=0.996)。嘧菌酯添加回收結果見表2，其平均添加回收率在101%～107%之間，相對標準偏差 (RSD) 在0.57%～6.3%之間，表明該方法具有較好的準確性及重現性。

表2 嘧菌酯在重組水中的平均添加回收率Table 2 Average recoveries of azoxystrobin added to the reconstituted water

2.2.2 混劑中嘧菌酯和總硒的濃度實測分析 結果表明，所有混劑處理組水樣中各藥劑成分的0 h和24 h 的實測濃度與理論濃度比值均滿足80%～120% 的要求 (表3) ，說明各藥劑成分的濃度在24 h 內相對穩定，因此，可用試驗設定理論濃度代替實測濃度，用于各藥劑成分對斑馬魚的急性毒性數據分析。

表3 二元混劑對斑馬魚成魚急性毒性試驗濃度含量測定Table 3 The measured concentrations in joint acute toxicity test of binary mixtures on adult zebrafish (D. rerio)

2.3 嘧菌酯、3 種外源硒單劑及其二元聯合的混劑對斑馬魚不同生命階段的急性毒性

嘧菌酯、3 種外源硒單劑及其二元等毒性配比的混劑對斑馬魚不同生命階段的急性毒性試驗結果見表4。

由表4 數據可見，斑馬魚對亞硒酸鈉的敏感性 (以96 h-LC50(致死中濃度)表示)順序為：仔魚>胚胎>成魚。胚胎孵化過程中出現心包水腫，卵黃囊水腫。成魚中毒癥狀為：魚體側翻，失去平衡。尾部色素沉積，尾鰭部出血；對硒代蛋氨酸的敏感性 (以96 h-LC50表示)順序為: 仔魚>胚胎>成魚。胚胎孵化過程中尾部分化不完全或畸形，孵化的仔魚出現心包水腫。成魚中毒癥狀為：魚體不規則上下游動，鰓出血，魚體彎曲。斑馬魚對納米硒的敏感性 (以96 h-LC50表示)順序為：成魚>仔魚>胚胎。胚胎孵化過程中，孵化后的仔魚出現心包水腫，脊柱彎曲。供試仔魚出現心包水腫，卵黃囊水腫，嚴重時脊柱彎曲約成直角，72 h可見心跳微弱，眼部抽搐。成魚中毒癥狀為：魚體側翻，出現不規律游動，色素沉積，嚴重時呼吸微弱，翻白肚，并伴有鰓出血等現象。

表4 嘧菌酯與3 種外源硒單劑及其二元等毒性配比的混劑對斑馬魚不同生命階段的急性毒性Table 4 Joint acute toxicity of binary mixtures in equitoxicity ratios of azoxystrobin and three kinds of exogenous selenium on zebrafish (D. rerio) during different life stages

2.4 混劑對斑馬魚不同生命階段的聯合毒性評價

分別采用AI 法、TU 法和MTI 法進行聯合毒性評價，結果如表5 所示，發現除MTI 法計算嘧菌酯與硒代蛋氨酸對成魚表現為部分相加作用外，采用AI 法、TU 法和MTI 法等3 種方法計算嘧菌酯與亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和納米硒對斑馬魚成魚、仔魚和胚胎的聯合作用結果一致，均表現為拮抗作用。

表5 嘧菌酯與3 種外源硒的二元等毒性配比的混合體系聯合毒性評價和作用類型Table 5 Joint toxicity evaluation and mode types of binary mixtures in equitoxicity ratios of azoxystrobin and three kinds of exogenous selenium

3 結論與討論

從結果可以看出，3 種外源硒對同一生命階段斑馬魚的影響存在差異，對于胚胎和仔魚而言，硒代蛋氨酸的毒性最大，其次是亞硒酸鈉和納米硒，但對于成魚而言則是納米硒的毒性最大。嚴旭霞等[30]研究表明，25 nm 的納米硒對斑馬魚胚胎毒性大于DL-硒代蛋氨酸，與本試驗中納米硒對胚胎毒性最低結果不一致 (本試驗納米硒平均粒徑約為150 nm)，這可能由于納米顆粒不同粒徑的尺寸效應導致。對于硒代蛋氨酸毒性大于亞硒酸鈉毒性，Bell & Cowey[31]在大西洋鮭魚的消化率試驗中觀察到，其對硒代蛋氨酸中的硒利用率最高 (91.6%)，其次是亞硒酸鈉 (63.9%)。不同類型硒的代謝途徑不同，導致硒在生物體內的蓄積量不同，少量無機硒會結合到受體蛋白中，大多數無機硒未能用于合成硒蛋白而進入腎臟，最終排出體外；硒代蛋氨酸可以代替硫氨基酸結合到受體蛋白中。這與Dolgova 等[32]的研究結果一致，其研究稱有機硒比無機硒對斑馬魚幼魚的毒性更大，推測可能與生物蓄積水平相關。

在AI 法、TU 法和MTI 法3 種聯合毒性評價方法中，除采用MTI 法計算嘧菌酯與硒代蛋氨酸對成魚表現為部分相加作用外，采用其余方法計算嘧菌酯與亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和納米硒對斑馬魚成魚、仔魚和胚胎的聯合作用結果一致，均表現為拮抗作用。通過測定供試混劑中嘧菌酯和不同外源硒二元混合之后的各自濃度，二者在水中濃度未受到明顯影響，說明二者混配不會發生化學反應。二元聯合表現出的拮抗作用的具體機理尚不明確，推測可能是供試斑馬魚對兩種不同成分在吸收和代謝方面存在差異。同時，拮抗作用也可能與混劑中硒與嘧菌酯的配比有關。近年來諸多文獻報道硒對受重金屬污染的動植物有修復作用，如Se-Hg 間存在拮抗作用[33]，而拮抗作用指兩種或多種藥物同時或相繼使用時，可導致藥物效應的減弱或消失。在本研究中，硒是否對暴露農藥中的供試生物有同樣作用機理進而表現為拮抗效應尚不清楚，目前農藥和硒聯合使用對田間生物的影響尚未見報道，具體的拮抗機理也有待進一步研究。