桃果套袋對6 種典型農藥沉積分布和殘留的影響

陳茜茜, 王曉珊, 趙洋洋, 邢天天, 張智超

(南開大學 農藥國家工程研究中心，天津 300071)

桃Prunus persica(L.) Batsch 屬薔薇科李屬桃亞屬，味美芳香，營養豐富，廣為人們所喜愛。我國的桃產量位居世界第一位，其總產量占世界桃總產量的54.0%[1]。桃在生產過程中主要病蟲害為穿孔病、褐腐病、炭疽病、流膠病、食心蟲、蚜蟲、紅蜘蛛和介殼蟲等。化學農藥施用是防治桃園病蟲害的主要措施，但不合理使用易導致農藥殘留，如毒死蜱、吡蟲啉、苯醚甲環唑和多菌靈等在桃中常有檢出[1-2]。

據報道，果實套袋有助于降低蘋果[3-6]、梨[7-8]、番茄和黃瓜[9]、香蕉[10]、芒果[11-12]、枇杷[13]中農藥的原始沉積量及最終殘留量；但也有研究結果表明，套袋可導致荔枝果實中甲氰菊酯和敵百蟲殘留量的增加[14]；此外，有研究表明，套袋會降低農藥在水果中的降解速率，且與農藥本身的性質有關[15-17]。然而，以上研究只關注了套袋對農藥在可食部位上沉積和殘留的影響，沒有研究套袋對農藥在作物葉片和土壤中沉積和殘留的影響；同時，有關套袋對農藥在桃園體系（桃葉、桃果和土壤）中沉積和殘留的影響尚未見報道。因此，本研究選擇用于桃樹的6 種典型登記農藥 (吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯) 為研究對象，開展桃果套袋和不套袋兩種處理對6 種農藥在桃園體系中沉積分布和殘留的影響，旨在為果農合理用藥及桃套袋技術提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 290 Infinity Ⅱ UPLC-6470A MS/MS，超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀 (配有電噴霧離子源 (ESI)) 和 Agilent 7890B GC-7000C QQQ，氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀 (配有電子轟擊離子源 (EI))(美國Agilent 公司)；TGL-15B 高速臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠)；CK2000 高通量組織研磨儀 (北京托摩根生物科技有限公司)；旋轉蒸發系統 (德國Heidolph 公司)；渦旋儀 (北京大龍興創實驗儀器有限公司)；XPE105萬分之一電子分析天平 (梅特勒-托利多集團)；SQP 百分之一電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統有限公司)；移液器 (德國Eppendorf 公司)。

吡蟲啉 (99.82%，imidacloprid)、嘧菌酯 (99.23%，azoxystrobin)、腈苯唑 (99.90%，fenbuconazole)、苯醚甲環唑 (99.90%，difenoconazole)、毒死蜱(99.89%，chlorpyrifos) 和β-氯氰菊酯 (97.82%，βcypermethrin) 標準品，購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；甲酸 (色譜純) 購于上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈和甲醇 (色譜純)購于北京迪科馬科技有限公司；高溫蒸餾水購于廣州屈臣氏食品飲料有限公司；N-丙基乙二胺 (PSA)、十八烷基鍵合硅膠 (C18) 和石墨化碳黑 (GCB, 40 μm)，購于天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 田間試驗

試驗于2019 年8 月下旬至9 月上旬在天津市靜海區進行。供試桃樹Prunus persica(L.) Batsch品種為當地主栽品種‘國慶王’，供試藥劑為10%吡蟲啉可濕性粉劑 (施藥劑量為2 500 倍液，下同)、325 g/L 苯甲 ? 嘧菌酯懸浮劑 (1 000 倍液)、522.5 g/L 氯氰 ? 毒死蜱乳油 (1 000 倍液) 和24%腈苯唑懸浮劑 (1 600 倍液)。混合施藥2 次，施藥間隔期為7 d。每小區3 棵桃樹，設套袋和不套袋兩個處理，每處理3 個重復。對于套袋處理組，選擇外黃內黑單層復合紙袋，并于果實套袋后開展施藥，施藥方式、濃度和時間與不套袋處理組相同。

取樣：1) 桃果及桃葉。分別于第2 次施藥后2 h 及1、3、7、14 和21 d 采用隨機取樣法，在試驗小區 (樹) 的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位采集12 個以上 (不少于2 kg) 生長正常、無病害、成熟的桃果實 (不少于12 個桃) 以及生長正常、新鮮的桃葉 (不少于0.5 kg)；2) 土壤。在桃樹的樹冠覆蓋范圍內，采用隨機取樣法，選擇9 個采樣點 (地表以下10 cm)，每個小區每次采集土壤樣本不少于2 kg。

采集的桃葉、桃果 (去除柄和果核) 和土壤樣品分別制備成實驗室樣品，于 ?20 ℃條件下保存。其中，桃果的檢測部位為去除果核后的整個果實，但殘留量計算為包括果核在內的整個果實。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 準確稱取一定量的樣品 (桃葉5.0 g、桃果10.0 g、土壤10.0 g) 于50 mL 聚乙烯離心管中，加入10.0 mL 體積分數為0.2% 的甲酸-乙腈溶液 (土壤樣品另加入3.0 mL 蒸餾水)，振蕩提取5 min，加入1.0 g 氯化鈉和4.0 g 無水硫酸鎂，振蕩3 min 后于4 000 r/min 下離心5 min，取上清液，待凈化。

1.3.2 樣品凈化 準確移取3.0 mL 上述上清液于25 mL 圓底燒瓶中，先在35 ℃的水浴溫度和10 kPa 左右的真空度下旋轉蒸發至干，再用1.5 mL 的V(丙酮) :V(異辛烷) = 1 : 1 溶液復溶后，轉移至裝有一定量凈化劑 (桃葉：20.0 mg GCB+40.0 mg PSA+150.0 mg 無水硫酸鎂；桃果和土壤：50.0 mg PSA+150.0 mg 無水硫酸鎂) 的2 mL 離心管中，渦旋1.5 min 后于8 000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 有機濾膜，待GC-MS/MS 測定毒死蜱和β-氯氰菊酯含量；另從離心后的50 mL 聚乙烯離心管中移取1.5 mL 上清液至另一個裝有一定量凈化劑 (桃葉：20.0 mg GCB+40.0 mg PSA+150.0 mg 無水硫酸鎂；桃果和土壤：50.0 mg C18+150.0 mg 無水硫酸鎂) 的2 mL 離心管中，渦旋1.5 min 后于8 000 r/min 下離心5 min；取上清液，過0.22 μm 有機濾膜，待UPLC-MS/MS 測定吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環唑含量。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(UPLC-MS/MS) 色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 (2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)；流動相A 為乙腈溶液，流動相B 為體積分數為0.2%的甲酸水溶液。梯度洗脫程序為：0 min 時20% A-80% B，0.50～1.50 min 為65% A-35% B，1.60 min 時變為90% A-10% B，保持到3.00 min，3.10 min 時恢復到初始流動相比例 (20% A-80%B)；流速為0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

質譜條件：帶有安捷倫噴射流技術的電噴霧離子源 (AJS ESI)，正離子掃描；多反應監測(MRM) 模式；毛細管電壓4.0 kV；霧化氣壓力1.7 × 105Pa；干燥氣流量10 L/min，溫度325 ℃；鞘氣流量11.0 L/min，溫度350 ℃；離子源溫度325 ℃；質譜參數見表1。

表1 吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環唑的質譜條件參數 (UPLC-MS/MS)Table 1 Mass spectrometry parameters for imidacloprid, azoxystrobin, fenbuconazole and difenoconazole (UPLC-MS/MS)

1.4.2 氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀 (GCMS/MS) 色譜條件：DB-17MS 色譜柱 (30 m ×250 μm，0.25 μm)；載氣為氦氣，柱流速1.3 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比5 : 1；進樣量1 μL；柱升溫程序為初始溫度120 ℃，以20 ℃/min 升至290 ℃，保持8 min。

質譜條件：電子轟擊離子源 (EI)；多反應監測 (MRM) 模式；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；碰撞氣為高純氮氣，流速1.5 mL/min；淬滅氣為高純氦氣，流速2.25 mL/min；溶劑延遲6.0 min；質譜參數見表2。

表2 毒死蜱和β-氯氰菊酯質譜條件參數 (GC-MS/MS)Table 2 Mass spectrometry parameters for chlorpyrifos and β-cypermethrin(GC-MS/MS)

1.5 方法確證

按照《農作物中農藥殘留試驗準則》[18]要求，通過線性范圍、添加回收試驗 (準確度和精密度)以及檢出限進行分析方法驗證。

1.5.1 標準溶液配制及標準曲線繪制 1) 分別準確稱取一定量的吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環唑標準品，用乙腈溶解，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的混合標準母液。2) 分別準確稱取一定量的毒死蜱和β-氯氰菊酯標準品，用異辛烷溶解，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的混合標準母液。用溶劑或經提取凈化后的空白基質溶液稀釋上述混合標準母液，配成0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 和5 mg/L 的系列標準工作溶液，按1.4 節的條件測定。以目標化合物質量濃度為橫坐標 (x，mg/L)，對應峰面積為縱坐標 (y) 繪制標準曲線。

1.5.2 基質效應 對于質譜，由于共同洗脫雜質的干擾影響電噴霧接口的離子化效率，從而引起離子化抑制或增強，導致出現假陰性或假陽性或不精確的定量，因此基質效應是質譜分析時方法驗證的重要參數[19]。按1.5.1 節所述，繪制溶劑匹配標準曲線和基質匹配標準曲線，按照公式 (1) 計算基質效應 (Me)。當Me的絕對值小于20% 時，認為可以忽略基質效應；反之，則應考慮消除基質增強或減弱效應[20-21]。

式中：A和B分別表示溶劑標準溶液曲線和基質匹配標準溶液曲線的斜率。

1.5.3 添加回收試驗 分別向空白桃葉、桃果及土壤樣品中添加6 種農藥標準溶液。GB 2763—2019[22]規定，吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯在桃中的最大殘留限量 (MRL) 分別為0.5、2、0.5、0.5、3 和1 mg/kg。根據上述規定，本研究設置了0.05、0.5 及5 mg/kg(桃果中為2 mg/kg) 3 個添加水平，每個水平5 個重復，另設空白對照。添加后混勻靜置30 min后進行提取測定，計算平均添加回收率及相對標準偏差 (RSD)。

此外，本研究還增加了桃葉中10 mg/kg (吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環唑) 和20 mg/kg(毒死蜱和β-氯氰菊酯) 的添加回收試驗，以覆蓋桃葉樣品檢測的最高殘留量。

1.6 數據處理

原始沉積量為所測得的各介質中原始沉積濃度，結合桃園種植體系中對應介質的生物量數據得到。其中，每棵桃樹上桃葉、桃果的總重估值分別以8 420 g 和12 000 g 計；土壤以每棵樹周邊半徑1 m、深度為10 cm、土壤容重為1.2 g/cm3的土壤重量計。

對同一種農藥在兩種處理下的殘留量數據，采用SPSS Statistics 17.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 方法驗證

2.1.1 線性范圍及基質效應 在0.01～1 mg/L 范圍內，吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯的質量濃度與對應的峰面積間呈良好線性關系，R2在0.987 3～1.000 之間。其中，6 種農藥在桃葉和土壤基質中的|Me|分別為48%～173%和29%～125%，基質效應明顯；在桃果基質中，嘧菌酯、腈苯唑和苯醚甲環唑的|Me|<7%，基質效應不明顯，而其余3 種農藥的|Me|均大于20%，基質效應明顯。考慮到基質效應及定量分析的需求，本研究采用基質匹配標準溶液進行校正定量分析。

2.1.2 方法的準確度和精密度 在0.05～20 mg/kg(桃葉)、0.05～2 mg/kg (桃果) 和0.05～5 mg/kg (土壤) 添加水平下，6 種農藥在桃葉、桃果和土壤樣品中的平均回收率在72%～111% 之間，RSD 在0.90%～18%之間 (n= 5)，可滿足農藥殘留檢測的要求[18]。以添加回收試驗的最低添加水平作為分析方法的定量限 (LOQ)，則6 種農藥的LOQ 均為0.05 mg/kg。

2.2 套袋對6 種農藥在桃葉、桃果及土壤中沉積分布規律的影響

分別測定6 種農藥在桃葉、桃果和土壤樣品中的原始沉積量。結果 (表3) 表明：桃果套袋后，6 種農藥在桃果上的原始沉積量大大降低，除毒死蜱外，其余5 種農藥的原始沉積量均低于定量限；土壤中的原始沉積量升高，但兩種處理下毒死蜱和β-氯氰菊酯在0.05 水平上差異不顯著(P<0.05)、嘧菌酯在0.01 水平上差異不顯著 (P<0.01)，其余3 種農藥在兩種處理下均有極顯著差異 (P<0.01)；對于桃葉，除苯醚甲環唑在兩種處理下差異顯著 (P<0.05) 外，其余5 種農藥的原始沉積量均無顯著差異 (P<0.05)。表明套袋可以有效隔離農藥與果實接觸，從而減少了農藥在果實上的原始沉積量，這與已有的文獻報道[5,8-9,13]相符。

表3 套袋和不套袋處理下6 種農藥在桃葉、桃果及土壤中的原始沉積量Table 3 The initial deposition contents of six pesticides in peach leaf, peach fruit and soil with fruit bagging and non-bagging

6 種農藥在桃葉、桃果及土壤中原始沉積量的占比規律見圖1。結果表明，不套袋處理下，農藥噴施后沉積量占比順序為桃葉 (56.7%～69.4%)>土壤 (25.3%～39.2%)>桃果 (3.3%～6.5%)(圖1A)。套袋后，苯醚甲環唑在土壤中的沉積量占比最大，其沉積量占比順序為土壤>桃葉>桃果；而其余5 種農藥的主要沉積部位依然為葉片，但桃葉和桃果中的沉積量占比明顯降低，土壤中的沉積量占比相對升高，分別為47.8%～64.3%、< 1% 和34.9%～52.2% (圖1B)。這可能是因為果袋的物理隔離作用不僅可以減少桃果與農藥的直接接觸而降低桃果中農藥的殘留量，而且可能會影響農藥在葉片上的原始沉積。套袋后葉片上的沉積量均有一定程度的下降 (4%～14%)，在施藥或采樣過程中的系統誤差可能造成苯醚甲環唑在桃葉中的沉積量顯著降低，從而影響其沉積量占比順序。

2.3 套袋對6 種農藥在桃中消解行為的影響

2.3.1 6 種農藥在桃葉中的消解規律 套袋和不套袋兩種處理下，6 種農藥在桃葉上的消解規律均符合一級反應動力學模型，其半衰期在4.8～26.7 d之間。其中，嘧菌酯和腈苯唑的半衰期相對較長，均大于20 d。此外，6 種農藥在套袋和不套袋兩種處理下的半衰期接近，表明桃果套袋對農藥在桃葉上的消解行為無影響 (表4)。

2.3.2 6 種農藥在桃果中的消解規律 套袋處理下，毒死蜱在桃果中的殘留量為0.06～0.1 mg/kg，其余5 種農藥的殘留量均低于LOQ (0.05 mg/kg)；但6 種農藥的消解動態試驗數據不規律，因此無法得到套袋處理下6 種農藥的消解動態曲線。

不套袋處理下，第2 次施藥后6 種農藥的殘留量隨時間呈明顯下降趨勢，亦符合一級反應動力學方程。除毒死蜱的半衰期為9.4 d 外，其余5 種農藥的消解速率均較慢，半衰期在19.3～36.5 d之間 (表4)。與已有的文獻報道[23-26]相比，本研究中6 種農藥在桃果上的半衰期相對較長。究其原因：一方面，作物品種以及作物的生長時期會影響農藥的半衰期，本試驗開展期間桃果處于成熟前的慢速生長期，可能會導致農藥消解速率慢；另一方面，可能還受試驗年份的不同氣候條件及環境條件等的影響。

表4 6 種農藥在桃葉和桃果中的消解動態Table 4 Dissipation dynamics of 6 pesticides in peach leaf and fruit

2.4 套袋對6 種農藥在桃果上最終殘留量的影響

由表5 可知，套袋和不套袋兩種處理下，第2 次施藥后14 和21 d 時6 種農藥在桃果中的最終殘留量均低于我國規定的MRL 值[22]，但與不套袋相比，套袋后6 種農藥在桃果上的殘留量均顯著降低 (p<0.05)。套袋后，除毒死蜱在第2 次施藥后14 和21 d 的殘留量分別為 (0.09 ± 0.01) mg/kg和 (0.06 ± 0.02) mg/kg 外，另外5 種農藥均未檢出。這與前人關于套袋后毒死蜱[5]、苯醚甲環唑[23]在蘋果中殘留，氯氰菊酯在翠冠梨[8]、黃瓜和番茄[9]中殘留的研究結論一致；而王建武等[14]、李胤均等[11]的研究結果表明，采取套袋前施藥的方式，套袋處理組的荔枝果肉和芒果中農藥殘留量增加，施藥方式的不同導致農藥殘留結果的差異。

表5 套袋處理對6 種農藥在桃果中最終殘留量的影響Table 5 The effect of bagging on the terminal residues of six pesticides in peach fruit

3 結論

本研究建立了利用超高效液相色譜/氣相色譜-串聯質譜 (UPLC-MS/MS 或GC-MS/MS) 測定桃葉、桃果和土壤中吡蟲啉、嘧菌酯、腈苯唑、苯醚甲環唑、毒死蜱和β-氯氰菊酯6 種農藥殘留的分析方法，該方法的平均回收率、相對標準偏差以及定量限均可滿足農藥殘留檢測的要求。

從沉積分布結果來看，果實套袋后施藥可以極大地降低農藥在桃果上的原始沉積量，6 種農藥在各介質中的沉積分布占比順序為桃葉>土壤>桃果，其中苯醚甲環唑可能因為施藥及采樣過程中的系統誤差造成了其沉積量占比順序不一致。從消解行為來看，6 種農藥在桃葉和桃果上的消解規律均符合一級反應動力學模型，在桃葉上消解半衰期為4.8～26.7 d，桃果中的消解半衰期為9.4～36.5 d；果實套袋對農藥在桃葉中的消解行為無影響，但顯著降低了6 種農藥在桃果上的殘留量，除毒死蜱外均低于LOQ。從最終殘留量 (第2 次藥后14 d 和21 d) 來看，套袋和不套袋兩種處理下6 種農藥在桃果中的殘留量均低于我國規定的MRL 值。