lncRNA GAS5調控Notch通路對骨髓間充質干細胞軟骨分化的影響

王勇超，粟欽，林昕，田強，傅美淳，張克云

湖南醫藥學院第一附屬醫院關節運動醫學科，湖南懷化418000

關節軟骨缺損是一種由多種因素造成的關節透明軟骨缺損，會導致關節僵硬、疼痛，加速關節退變，由于關節軟骨缺乏血管及淋巴，其自我修復能力極其有限。傳統骨髓刺激療法對關節軟骨缺損的治療效果較差，目前以骨髓間充質干細胞（BMSCs）為基礎的軟骨組織工程已被認為是治療軟骨缺損的一種有效方法［1-2］。BMSCs 是一種具有高度分化能力的多能干細胞，可分化為軟骨細胞、成骨細胞，用以修復缺損組織［3］。因此，有效促進BMSCs 軟骨分化對關節軟骨缺損患者的治療極其重要。近年來，長鏈非編碼RNA（lncRNA）在調節BMSCs 軟骨分化中的作用逐漸得到關注［4］。研究發現，lncRNA 生長停滯特異性轉錄本5（GAS5）參與了骨關節炎等軟骨損傷疾病的發生，其高表達可促進BMSCs 的成骨分化，延緩骨骼疾病進展，但目前關于其對BMSCs 軟骨分化的影響鮮見報道［6］。Notch 通路在間充質干細胞（MSCs）的維持及細胞增殖過程中具有重要作用，抑制其激活可顯著促進MSCs 的軟骨分化［7］。研究顯示，Notch 通路在關節軟骨損傷患者的軟骨組織中被顯著激活［7］。目前關于 lncRNA GAS5 是否可能通過調控Notch 通路而影響BMSCs 軟骨分化尚不明確，為此我們于 2020 年 1 月—2021 年 2 月進行了如下研究，為研究BMSCs 軟骨分化的發生機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠5 只，7 周齡，體質量200～255 g，均購自揚州大學；在明暗交替12 h/12 h 環境中適應性飼養7 d，許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。

1.1.2 主要試劑 Notch 信號通路特異性阻斷劑2，4-二氨基-5-苯噻唑（DAPT，30050619）購自深圳海思安生物技術有限公司；兔抗Notch1、β-actin 抗體（3608、4970）均購自美國CST公司，兔抗Split多毛增強子1（Hes-1）、Ⅱ型膠原纖維α1（COL2a1）、蛋白聚糖（Aggrecan）抗 體 、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）均 購 自 美 國 Abcam 公 司 ；CD90-FITC（328107）購 自 美 國 BioLegend 公 司 ，CD45-FITC（555482）購自美國BD Biosciences 公司，CD29-FITC（MCA1949F）購自美國Bio-Rad 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒（PN0120-500T、EX6110-100T）均購自定州百克賽斯生物科技有限公司，反轉錄試劑盒（K1622）購自武漢科昊佳生物科技有限公司，qRT-PCR 檢測試劑盒（QPG-020～QPG-023）購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 BD FACSCANTO Ⅱ流式細胞儀（BD001）購自上海基泰生物科技有限公司，Monad（莫納）QuickGel 6100 凝膠成像系統（IN0611）購自北京必吉生物科技有限公司，ABI Step One Plus 實時熒光定量PCR 儀購自北京希凱恩生物科技有限公司。

1.2 BMSCs的分離、培養與鑒定

1.2.1 BMSCs 的分離、培養 將5 只大鼠頸椎脫臼處死后浸入75%乙醇中10 min，移入超凈工作臺中分離股骨，用10 mL DMEM 培養基（低糖、10%胎牛血清）沖洗骨髓腔并收集骨髓細胞，反復吹打使骨髓細胞懸液混勻，并調整細胞密度為5×105/mL。將細胞接種于培養瓶（50 mL）中，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養，至細胞融合度達80%時使用0.25%胰酶消化傳代，在此期間每隔2 d更換一次培養液。

1.2.2 BMSCs 的鑒定 細胞培養到第3 代時，用倒置相差顯微鏡觀察BMSCs形態；結果顯示，第1代分離的細胞呈長梭形或三角形；第3 代細胞形態為均一的長梭形，且呈現旋渦狀、魚群樣分布。0.25%胰酶消化第3 代BMSCs，1 000 r/min離心5 min棄去上清液，添加300 μL PBS 重懸后移入到流式管中，分別添加 5 μL CD90-FITC、CD29-FITC、CD45-FITC抗體，混勻避光孵育0.5 h，在流式細胞儀中檢測BMSCs 表面標志物；結果顯示，CD90 與 CD29 陽性表達率分別為98.16%、96.22%，而CD45 陽性表達率為0.89%。

1.3 細胞分組及處理方法 將第3 代BMSCs 分為對照組、p-EGFP-C1 組（轉染 p-EGFP-C1 空載體質粒）、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 組（轉染p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 過表達質粒）、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 組（轉染 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 過表達質粒并添加 100 ng/mL DAPT）［8］；將 100 μL BMSCs 接種到 6 孔板中（5×103/mL），使用 Lipofectamine 2000 轉染試劑盒進行質粒轉染，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養24 h。

1.4 細胞lncRNA GAS5 表達檢測 采用qRT-PCR法。收集轉染后的各組細胞，使用TRIzol 法提取細胞總RNA，檢測其濃度及純度合格，使用反轉錄試劑盒對其進行反轉錄，以所得到的cDNA 為模板進行qRT-PCR 擴增。引物序列：lncRNA GAS5 上游引物5'-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3'、下游引物5'-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3'，內參 GAPDH 上游引物5'-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3'、下游引物5'-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'。 采 用 2－ΔΔCt法計算lncRNA GAS5相對表達量。

1.5 軟骨分化誘導及鑒定

1.5.1 軟骨分化誘導 將各組細胞置于成軟骨誘導培養基中，培養14 d。軟骨誘導培養基為包含10 mmol/L β-磷酸甘油、0.05 mmol/L 抗壞血酸、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 nmol/L地塞米松、10 ng/mL轉化生長因子β（TGF-β）的 DMEM 培養基（低糖、10%胎牛血清）。

1.5.2 軟骨細胞形態鑒定 采用HE 染色。將軟骨誘導培養14 d 后的各組細胞進行胰酶消化，調整細胞密度為1×105/mL，滴加到6孔板中的蓋玻片上。培養24 h后取出細胞爬片，經乙醇固定20 min、蘇木精核染2 min、伊紅復染1 min，晾干、封片，光鏡下觀察細胞形態及數量變化。

1.6 軟骨細胞特征性分泌物COL2a1、Aggrecan 表達檢測 采用免疫細胞化學法。4%多聚甲醛固定細胞爬片20 min，PBS 洗滌后使用0.1% Triton X-100 浸泡10 min，3%過氧化氫處理15 min，1%胎牛血清白蛋白封閉1 h。4 ℃加入COL2a1、Aggrecan 抗體孵育過夜，次日加入山羊抗兔IgG 二抗孵育1 h，在SABC 濕盒內孵育30 min。DAB 顯色后蘇木精復染，經流水中返藍后脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并拍照。棕黃色為陽性染色細胞，計算陽性表達率。陽性表達率=陽性染色細胞/視野范圍內細胞數×100%。

1.7 軟骨細胞Notch 通路相關蛋白（Notch1、Hes-1）表達檢測 采用Western blotting 法。使用RIPA 裂解液對各組細胞進行裂解，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度。行SDS-PAGE 凝膠電泳（每個泳道中添加30 μg 蛋白）分離蛋白，按照分子量大小進行切膠、轉膜，封閉后添加兔抗Notch1、Hes-1、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），次日加入HRP 標記的IgG 二抗（稀釋比例1∶5 000），孵育2 h。ECL 化學發光試劑顯影，蛋白凝膠成像系統觀察，Image J軟件分析Notch1、Hes-1、β-actin 條帶灰度值，計算 Notch1、Hes-1 蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞lncRNA GAS5表達比較 對照組、p-EGFP-C1 組、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 組、p-EGFPC1-lncRNA GAS5+DAPT 組 細 胞 lncRNA GAS5 相 對表達量分別為 1.00 ± 0.12、1.01 ± 0.10、1.52 ±0.18、1.50 ± 0.19，p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 組、p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 組 細 胞 lncRNA GAS5 相對表達量均明顯高于對照組、p-EGFP-C1 組（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞誘導軟骨分化后的形態及數量觀察情況比較 各組細胞均呈軟骨細胞形態改變，即呈三角或多角形，細胞核為藍紫色，細胞質和細胞外基質為紅色，成團生長；p-EGFP-C1-lncRNA GAS5組與p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 組軟骨細胞數量明顯多于對照組和p-EGFP-C1 組，以p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT組軟骨細胞數量最多。

2.3 各組細胞COL2a1、Aggrecan 陽性表達率比較 與對照組及p-EGFP-C1 組比較，p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 組及p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT組細胞COL2a1、Aggrecan 陽性表達率均升高，且p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT組升高更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞COL2a1、Aggrecan陽性表達率比較（）

表1 各組細胞COL2a1、Aggrecan陽性表達率比較（）

注：與對照組及 p-EGFP-C1 組比較，*P＜0.05；與 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5組比較，#P＜0.05。

Aggrecan（%）6.92±0.86 7.03±1.10 43.23±8.16*65.50±9.27*#組別對照組p-EGFP-C1組p-EGFP-C1-lncRNA GAS5組p-EGFP-C1-lncRNA GAS5組+DAPT組COL2a1（%）4.20± 0.75 4.18± 1.33 49.90± 7.63*75.12±10.36*#

2.4 各組細胞Notch1、Hes-1 蛋白表達比較 與對照組及p-EGFP-C1 組比較，p-EGFP-C1-lncRNA GAS5 組 及 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT 組 細 胞Notch1、Hes-1 蛋白相對表達量均降低，且p-EGFPC1-lncRNA GAS5+DAPT 組 降 低 更 明 顯（P均 ＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞Notch1、Hes-1蛋白相對表達量比較（）

表2 各組細胞Notch1、Hes-1蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組及 p-EGFP-C1 組比較，*P＜0.05；與 p-EGFP-C1-lncRNA GAS5組比較，#P＜0.05。

Hes-1 1.05±0.10 1.06±0.17 0.63±0.06*0.30±0.04*#組別對照組p-EGFP-C1組p-EGFP-C1-lncRNA GAS5組p-EGFP-C1-lncRNA GAS5+DAPT組Notch1 1.40±0.22 1.38±0.25 0.92±0.15*0.52±0.10*#

3 討論

關節軟骨作為滑膜關節重要的功能單位，具有潤滑、抗磨損、吸收震動、傳導載荷等作用，一旦受到損傷就會造成不可逆的病理變化，導致骨關節炎的發生，嚴重影響患者的日常行走及生活質量［1］。由于關節軟骨中不含神經組織、淋巴、血管，使得其自我修復能力十分受限，而傳統的藥物治療及關節置換術等方法雖然有效，但仍有三分之一的患者不甚滿意，因此迫切需要尋找新的治療方法［9-11］。MSCs具有自我更新及多向分化能力，目前BMSCs 已在動物模型及臨床病例中被廣泛研究，顯示出具有通過誘導軟骨分化來治療骨關節炎的潛能［9，12］。本研究從大鼠骨髓中分離出BMSCs，經倒置顯微鏡觀察細胞形態及表面標志物鑒定CD90、CD29呈高表達，而CD45 呈低表達，證實成功分離出BMSCs，可用于后續實驗。

lncRNA 能通過與相關轉錄因子相互作用來參與調控干細胞的維持和分化。研究發現，lncRNA 參與了關節軟骨細胞的分化過程［12-13］。研究顯示，lncRNA GAS5 能夠減輕骨關節炎小鼠的關節軟骨破壞，并可能通過抑制核因子 κB（NF-κB）和Notch 信號通路來改善脂多糖誘導的ATDC5 軟骨細胞凋亡及炎癥損傷［14-15］。研究發現，lncRNA GAS5 過表達可通過抑制微小RNA-498（miR-498）表達，來促進人MSCs 成骨分化，緩解骨質疏松癥［6］；此外，lncRNA GAS5 可通過抑制miR-135a-5p/叉頭轉錄因子O1（FOXO1）通路來促進BMSCs 成骨分化［16］。本研究結果顯示，lncRNA GAS5 過表達可顯著增加軟骨細胞特征性分泌物COL2a1、Aggrecan 表達及軟骨細胞數量，提示lncRNA GAS5 能夠有效促進BMSCs 的軟骨分化，為軟骨損傷的治療提供了一個潛在靶點。

Notch 通路是一個相對保守的信號通路，當Notch 受體（Notch1～Notch4）與其配體相結合后，會導致蛋白水解并釋放Notch 胞內結構域（NICD）。NICD 易位至細胞核能夠調節Hes-1 等下游基因轉錄，以此參與調控胚胎發育、細胞增殖及分化。近年來有研究發現，Notch 通路不僅參與調控軟骨形成，還參與了軟骨細胞的成熟過程，激活該通路可抑制軟骨分化［7，17］。研究顯示，Notch通路下游因子Hes-1表達升高會抑制ATDC5 細胞軟骨細胞標志物表達［17］，而miR-9可通過抑制Notch 信號通路而促進骨關節炎模型兔的軟骨再生［18］。還有研究發現，Notch信號通路激活可顯著抑制骨形態發生蛋白9（BMP-9）誘導的 MSCs 成骨及成軟骨分化［8］。本研究結果顯示，lncRNA GAS5過表達能顯著降低Notch1、Hes-1蛋白表達，表明lncRNA GAS5 過表達能夠有效抑制BMSCs 中的Notch 信號通路激活。本研究還發現，Notch 通路抑制劑能夠進一步增強lncRNA GAS5 過表達對BMSCs 軟骨分化的促進作用，為軟骨損傷的治療提供了新的研究方向。

綜上所述，lncRNA GAS5可通過抑制Notch通路激活來促進BMSCs的軟骨分化。本研究不僅為BMSCs軟骨分化機制的研究提供參考，還為軟骨損傷治療提供了新的研究思路。但本研究未對該通路的下游機制進行深入探討，是未來深入研究的方向之一。