外源脫落酸對濕地植物美人蕉抗寒性的影響

陳金梅 褚一凡 譚啟洋 劉 偉 楊玲麗 黃 濤 吳振斌 賀 鋒

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

人工濕地是人工建造的, 通過基質、植物和微生物的物理、化學、生物三重協同作用來凈化污水的一種技術[1]。植物作為人工濕地重要組成部分之一, 不僅能攝取利用污水中營養物、吸收富集有毒有害物質, 還具有傳輸氧氣、強化根際微生物、增強和維持介質的水利傳輸等作用。然而植物在人工濕地污水凈化過程中的作用與其生長狀況密切相關, 在氣溫低下的冬天, 植物進入休眠期甚至枯萎死亡, 不能在濕地系統中充分發揮其功能, 從而導致人工濕地系統在冬季凈化效果下降。

目前現有的提高濕地植物的抗寒性方法主要有天然植物的抗寒性篩選[2,3]、誘變育種[4,5]和化學誘導[6]。本研究采用脫落酸處理濕地植物, 以期提升其抗寒性能。脫落酸(Abscisic acid, ABA) 作為植物五大激素之一, 是一種存在于植物體內的具有倍半萜結構的內源激素。有研究表明[7], ABA 作為重要的逆境信號分子, 可誘導抗寒基因發揮作用,即, 當植物遭受低溫脅迫時, 植物體內 ABA 會迅速累積, 啟動或誘導植物自身抗寒基因的表達, 參與低溫脅迫信號傳導途徑, 從而使植物更快適應寒冷。ABA參與的抗寒過程一般分為3種: 一種是ABA依賴途徑, 主要受轉錄因子和ABRE的調控[8,9],如PYR/PYL/RCARs(受體)、PP2C(負調控)和SnRK2s(正調控); 另外逆境誘導基因 RD28 和RD29 等也受ABA調控; 第二種是非ABA依賴途經,然而ABA的信號傳導還是會影響基因的表達, 如lti78; 第三種是ABA與低溫協同作用下才進行表達的基因, 例如cor47基因在經外源ABA處理后, 表達量有所升高[10,11]。由于研究ABA的相關生理過程可反映植物的抗逆機理, 揭示其應答基因及表達蛋白, 可定向增強作物對環境的適應力, 故被廣泛應用于園藝和農業生產的抗寒性[12,13]、抗旱性[14,15]、鹽脅迫[14]及沉水植物的金屬脅迫[16,17]中。綜上所述, 適宜濃度下的外源脫落酸預處理可增強植物抗逆生物效應, 但其在濕地植物領域的研究還未見報道。因此, 本研究擬將外源脫落酸應用于濕地植物美人蕉上探究其在低溫狀態下的生理響應。

美人蕉(Canna indicaL.)屬多年生熱帶和亞熱帶植物, 喜溫, 抗寒能力差, 生物量大, 適應力強, 根系發達, 被廣泛應用于長江中下游的人工濕地系統中。時至今日, 已有學者對提高濕地植物的抗寒性進行大量探索, 但尚未探究外源脫落酸對濕地植物美人蕉耐寒性的影響。故本研究將采用不同濃度ABA處理美人蕉幼苗的葉片, 通過測定其抗寒指標的變化, 確定最適宜的脫落酸施用濃度, 再將其應用于人工濕地小試系統中, 探究適宜濃度的外源ABA對美人蕉植物本身抗寒能力的影響及其對自然冬季條件下人工濕地水質的反饋效果, 為突破濕地系統低溫運行瓶頸提供新思路。

1 材料與方法

1.1 植物處理與方法

紅花美人蕉幼苗來自于中國科學院水生生物研究所官橋研究基地, 取長勢相近的美人蕉幼苗移植于塑料盆中, 幼苗高度為30—50 cm, 從基地移栽后在恒溫室進行14d的緩苗期, 待長勢穩定后, 放入低溫光照培養箱中, 每組設置3個平行, 均重復實驗3次。

試驗設 6 個處理組, 為 0、5、10、15、20和25 mg/L ABA, 對照組(CK)為0 mg/L ABA美人蕉幼苗組。為模擬自然降溫及日夜溫差等因素, 本實驗采取階段性降溫培養, 低溫光照培養各階段的溫度梯度設置為晝/夜20℃/18℃、 15℃/13℃、10℃/8℃、 5℃/3℃和0℃/0℃, 光照參數為2300 lx, 8h。每個溫度持續3d, 3d后自動降至下一梯度, 且在溫度梯度切換時噴施一次相應濃度ABA至葉面完全浸濕, 于0℃時采集植株頂部從上往下第 2 至第 3位葉, 液氮冷凍保存于-80℃冰箱中, 留存并測定其相關生理生化指標。

1.2 植物生理生化指標測定

各項生理生化指標的測定參照李合生等[18—20],相對電導率采用電導法, 丙二醛測定采用硫代巴比妥酸法, 脯氨酸采用茚三酮顯色法, 總可溶性糖采用蒽酮-硫酸比色法, 可溶性蛋白質采用考馬斯亮藍G-250法, SOD測定采用氮藍四唑法, CAT測定采用過氧化氫比色法, POD采用愈創木酚法, 葉綠素測定采用乙醇法。

1.3 實驗裝置與方法

本研究采用垂直流人工濕地, 裝置為內徑200 mm、管高870 mm的PVC管, 裝置內填充基質依次為100 mm高的粒徑為5—8 mm粗礫石、300 mm高的粒徑為2—4 mm細礫和200 mm高的粒徑為0.5—1 mm石英砂(圖 1)。裝置正式運行時間為2019年12月至2020年1月, 采取自然降溫模式, 裝置設3個平行, 組別分別為無植物組(A組)、植物對照組(B組)和ABA噴施處理組(C組), 植物對照組和ABA噴施處理組各種植一株紅花美人蕉, 種植深度10 cm。進水采用自配水, 配方如下: 蛋白胨80 g/m3、牛肉膏55 g/m3、葡萄糖100 g/m3、NaCl 3.5 g/m3、NH4Cl 28.5 g/m3、CaCl22 g/m3、MgSO41 g/m3和K2HPO419 g/m3。主要指標含量為CODcr (211.6±37.6) mg/L、TN (28.07±1.83) mg/L和TP (2.62±0.25) mg/L。

圖1 試驗裝置圖Fig. 1 Illustration of test installation

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0單因素方差分析對植物生理生化指標進行統計分析, 采用SPSS 17.0單因素方差分析對人工濕地各處理組和對照組的去除率進行統計分析, 各分析的顯著性水平為P＜0.05, 并用Origin8進行繪圖。

2 結果

2.1 0℃時各處理組生理指標含量變化的情況

細胞膜系統丙二醛(MDA)、相對電導率含量的變化由圖 2可以看出, MDA各組之間均有顯著性差異(P＜0.05), 其中15 mg/L脫落酸處理的美人蕉幼苗的MDA相比對照組降低了50.24%。此外, 在0℃時(圖 3), 相對電導率各處理組與對照組之間均有顯著性差異(P＜0.05), 但各處理組之間無顯著性差異。

圖2 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片丙二醛的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of ABA on malondialdehyde in Canna indica L. at 0℃

圖3 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片相對電導率的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of ABA on relative conductivity in Canna indica L. at 0℃

在低溫條件下, 相比于對照組, 15和20 mg/L的ABA處理組顯著地增加脯氨酸在美人蕉幼苗葉片中的含量(P＜0.05), 相較于對照組增加到2.113倍(圖 4), 15 mg/L的ABA處理組顯著地增加蛋白質在美人蕉幼苗葉片中的含量, 且相較于對照組增加到2.01倍(圖 5)。此外, 10 mg/L的ABA處理組顯著地增加可溶性糖在美人蕉幼苗葉片中的含量, 相比于對照組增加到3.095倍(圖 6)。

圖4 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片脯氨酸的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of ABA on proline content in Canna indica L. at 0℃

圖5 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片蛋白質的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of ABA on soluble protein content in Canna indica L. at 0℃

圖6 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片總可溶性糖的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of ABA on total soluble sugar content in Canna indica L. at 0℃

抗氧化酶活性的變化由圖 7可以看出, 0℃時經ABA處理的美人蕉幼苗與對照組相比均有顯著性提高, 且10 mg/L處理組尤為顯著(P＜0.05)。POD酶規律性不強, 只有在25 mg/L處理組下才與對照組有顯著性差異(圖 8)。CAT酶也可反映植物的抗逆性, 但在本實驗中與對照組無顯著性差異(圖 9)。

圖7 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片SOD的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of ABA on activities of SOD in Canna indica L. at 0℃

圖8 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片POD的影響Fig. 8 Effects of different concentrations of ABA on activities of POD in Canna indica L. at 0℃

圖9 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉片CAT的影響Fig. 9 Effects of different concentrations of ABA on activities of CAT in Canna indica L. at 0℃

葉綠素含量變化由圖 10可以看出, 10、15、20和25 mg/L 的ABA處理組相比對照組均有顯著性提高(P＜0.05), 其中經15 mg/L ABA處理組與對照組相比, 可將植物葉片中的葉綠素提高1.8倍。

圖10 0℃時不同濃度ABA對美人蕉葉綠素的影響Fig. 10 Effects of different concentrations of ABA on chlorophyll in Canna indica L. at 0℃

2.2 人工濕地系統冬季運行效果

表1所示為人工濕地運行在冬季運行期間的采樣時間及當日的最低最高溫度統計結果, 運行期間的COD、 TP和TN去除率測定結果如圖 11—13所示。

表1 冬季應用試驗期間溫度實測結果Tab. 1 Illustration of temperature measurement during winter

圖11 冬季COD去除率趨勢圖Fig. 11 Removal rates of COD in winter

由COD去除率結果可知, A組(無植物組)COD去除率為58.73%, B組(植物對照組)去除率為70.27%, C組(ABA噴施組)去除率79.49%, 三組間COD去除率有顯著性差異(P＜0.05)。對TP去除率分析可知, A組去除率為23.69%, B組去除率為35.34%, C組去除率30.98%, 有植物組顯著高于無植物組(P＜0.05), 但植物對照組與ABA噴施組無顯著性差異, 這可能與冬季植物未完全枯萎相關。由圖 13可知, A組去除率為26.67%, B組去除率為32.68%, C組去除率41.16%, 在試驗前期, 三組TN去除率沒有顯著性差異且處于較平穩狀態, 到后期,植物長勢較好的組TN的去除率顯著高于無植物組。

圖12 冬季TP去除率趨勢圖Fig. 12 Removal rates of TP in winter

圖13 冬季TN去除率趨勢圖Fig. 13 Removal rates of TN in winter

3 討論

3.1 各處理組抗寒性比較分析

在高等植物體內, 細胞膜系統最容易受到低溫迫害。低溫會影響膜的通透性, 從而使細胞膜受損, 根據文獻調研, 相對電導率也與膜損傷程度呈正比[21—23]。在逆境脅迫下, 植物體內原有的自由基平衡被破壞, 多余的自由基會引發或加劇膜脂過氧化作用[24]。膜脂過氧化的主要產物之一丙二醛(MDA), 其積累會對植物細胞膜造成一定傷害, 因為它會和與蛋白質、核酸結合, 抑制相關蛋白質的合成, 甚至可以減弱纖維素分子間的橋鍵連接[19,20,24]。在對水稻[25]、油棕[26]和甘蔗[27]等的研究中發現, 在外源 ABA 處理下, 植物體內中的MDA 積累量和相對電導率均降低, 進而減輕低溫對細胞膜的脅迫作用[28]。在本實驗研究中也有相似結論, 0℃時外施脫落酸通過降低相對電導率及丙二醛含量減緩低溫脅迫給膜結構帶來的損傷, 維持膜正常生理功能,誘導抗寒基因表達, 從而增強植物抗冷性。究其原因, 推測是外源ABA 可提高水分由根系向葉片輸送效率, 提高細胞膜透性, 從而使膜的穩定性增加以減少電解質的滲漏, 此外, ABA還可誘導有關基因表達進而提高植物對寒冷的抵抗能力[27,29]。由圖 2可知, MDA濃度隨ABA濃度呈現先增后降再升的趨勢, 推測低濃度或高濃度的ABA預處理會加重寒害對植物葉片細胞膜的損傷, 據圖 3可知, 相對電導率在所選濃度區間呈現相似的效果, 據文獻[22, 23]可知, ABA對細胞膜有一定的保護作用, 但針對不同植物其對相對電導率的處理敏感度較低,效果一般, 而適宜濃度下更能緩解膜脂氧化程度,故需要多個生理生化指標來綜合判斷。

在低溫脅迫下, 植物細胞通過積累一些滲透調節物質來緩解低溫對植物本身造成的傷害[30—32]。其中, 參與相關過程的滲透調節物質有脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖, 一方面可保護蛋白質分子來緩解低溫脅迫對細胞傷害, 另一方面啟動植株體內的抗寒機制, 誘導合成相關蛋白質, 形成脫落酸等物質[28,33—35]。以往的研究結果表明, 施加外源ABA 可通過提高植物體中可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸等滲透調節物質的含量來增強植物的抗寒性, 并使其逐漸適應低溫環境[33,36]。在本實驗中, 在0℃時, ABA濃度與可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量整體均呈現低促高抑的趨勢, 這說明在適宜濃度的ABA預處理下, 美人蕉幼苗體內通過調節滲透物質來平衡細胞內外物質, 此外細胞膜的穩定性也會大大增強, 進而提高美人蕉幼苗對低溫的抵抗能力[21]。

低溫會降低植物對 O2的利用能力, 打破植物體內的活性氧( Reactive Oxygen Species, ROS)平衡, 過量的ROS會攻擊細胞大分子, 引起一系列有害的生化反應, 造成蛋白質損傷、脂質過氧化、DNA 突變和酶失活等, 進而損傷植株[24,37—39]。在本研究中, SOD、POD和CAT未見明顯的規律性,這一現象的產生可能與美人蕉響應低溫脅迫的不同途徑有關, 也可能是ABA預處理對該系統的效果不顯著或者是美人蕉物種與其他物種間響應機制的差別, 尚需進一步研究, 但此結果與前人在茶葉葉片[36]、玉米幼苗[40]和橡膠樹芽[41]等中的研究結論相符。

葉綠素是作物進行光合作用的主要物質, 是植物所有生命活動的基礎。低溫脅迫會使葉綠素合成受阻, 且低溫脅迫時間越長, 葉綠素含量越少, 伴隨著葉綠素含量的降低, 葉片光合作用也隨之衰退[42]。研究表明, 造成葉綠素含量減少的原因有很多, 一部分學者[35,43—45]認為, 低溫使原有葉綠素受到破壞是葉綠素含量減少的主要原因; 另一部分學者[46]則認為葉綠素含量的下降主要是因為低溫限制了葉綠素的合成。而逮明輝等[47]認為在低溫下葉片的葉綠素降解加劇, 合成能力降低, 才是導致葉綠素總含量下降的主要原因。本研究發現, 適宜濃度的脫落酸應用可以提高低溫脅迫下美人蕉葉片中葉綠素含量, Wang 等[48]認為被植物色素A(phyA)和phyB感知到的遠紅光(FR)和紅光(R)分別正向和負向調節番茄的耐寒性, 這種調節有關脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)等植物激素及ABA和JA相關基因相關, 而此種響應在水稻[49]和Bermudagrass[50]中也有發現。

3.2 人工濕地低溫狀態下凈化效果比較分析

有研究認為, 人工濕地即使在冬季低溫下仍對COD有較好的去除率[51]。本研究證明, 植物確實可顯著提高濕地對COD的去除, 且植物在冬季長勢越好, 存活時間越久, COD的去除效率就越高, 這與華昇等[52]研究結果相符。濕地植物在生長過程中的營養來源是污水中的無機氮[53], 已有研究表明, 不同濕地植物對 TN 的吸收量僅占人工濕地 TN 去除量的 0.6%—17.3%[54], 本實驗也可看出在寒冷的冬季, 人工濕地的TN的去除率偏低, 植物的對N的同化吸收確實可以在一定程度上提高冬季濕地的運行效果。眾多學者認為, TN的去除率因季節原因波動較大[55], 夏季TP的去除率比冬季高6.1%—34.0%[56]。而本實驗結果表明, 植物耐寒性的提高對人工濕地中TN的去除率影響較小, 推測是因為植物對磷的去除起小部分作用, 主要還是靠基質的吸附和微生物的作用。

4 結論

在低溫脅迫下, 一定濃度的外源脫落酸預處理使美人蕉葉片中的葉綠素、脯氨酸、可溶性糖和蛋白質含量升高, 丙二醛含量和相對電導率降低,但SOD、POD和CAT未見明顯的規律性, 綜合各項生理生化指標及表觀現象, 適宜的ABA處理濃度為15 mg/L。用15 mg/L的脫落酸對美人蕉幼苗進行預處理時可顯著提高人工濕地冬季TN、COD和TP去除率。