5/6腎臟切除動物疾病模型的中醫證候探索及扶正化瘀降濁通絡方證測驗*

陳紫薇， 陳 明， 何凱杰， 陳艷瓊

(1.成都市中西醫結合醫院， 成都 610000；2.成都中醫藥大學附屬醫院， 成都 610000)

慢性腎衰竭(chronic renal failure, CRF)是多種原發和繼發性腎臟病變持續進展的共同結果，嚴重危害人類健康和生命[1]。近年研究發現，中醫藥在延緩腎病進展方面療效獨特，但作用機制尚不明確，需深入探討。動物模型是中醫藥機制研究的重要載體，5/6腎切除大鼠模型是通過手術方式減少有效腎單位，從而建立的一種CRF經典西醫動物疾病模型[2]，但是中醫藥研究需要“病證結合”[3]，此模型是否能用于中醫藥機制研究，值得進一步探討。

有人發現，機體細胞免疫功能(CD4+T細胞、CD8+T細胞)的變化與中醫“正虛證”密切相關[4-6]，而C反應蛋白(c reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6等微炎癥狀態指標，被認為是機體“邪實證”的重要物質學基礎[6-8]。同時中醫認為CRF病程長，病勢纏綿難愈，多見“虛實夾雜證”。本研究擬從宏觀方向(大鼠一般情況)和微觀方向(細胞免疫功能和微炎癥狀態指標)研究5/6腎切除大鼠的中醫證候變化，同時通過“以方測證”[9]，使用前期臨床研究對CRF療效確切的經驗方——扶正化瘀降濁通絡方干預5/6腎切除大鼠，進一步探討其中醫證候，以期明晰此模型是否能夠作為中醫藥機制研究的理想模型，為CRF“正虛邪實證”的中醫藥研究提供載體。本研究已通過成都中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審查,批準號SCEC2019-051-01。

1 材料

1.1 動物

SPF級別雄性SD大鼠54只，體質量(190±20) g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證號scxk(川)2015-030。飼養環境溫度(25±2) ℃，相對濕度50%～70%，自由進食與飲水。

1.2 主要試劑與儀器

Anti-rat CD4抗體、Anti-rat CD8a抗體(Bio Legend 公司，貨號分別為201511、200607)；CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(Becton Dickinson公司，貨號分別為7172720、P150695、P150683、P149504)。

全自動生化分析儀(Siemens公司，型號ADVIA2400)；流式細胞儀(BD公司，型號FACSAria III)；酶標分析儀(TECAN公司,型號sunrise)；臺式離心機(江蘇湘儀公司，型號L500)；洗板機(SYM-Bio Life Science公司, 型號Egate2310)。

1.3 藥物

扶正化瘀降濁通絡方組成：黃芪(批號1702001)、熟地黃(批號1704098)、甘草(批號1607078)、丹參(批號1610049)、紅花(批號1704094)、土鱉蟲(批號1604061)、酒水蛭(批號1612015)、酒黃芩(批號1609043)、酒大黃(批號170107)，均購于成都中醫藥大學附屬醫院的中藥房，按照傳統中藥煎煮方法制備用于灌胃的中藥水煎劑，濃縮煎劑至5.24 g/mL(含扶正化瘀降濁通絡方生藥)備用。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥

將SD大鼠隨機分成假手術組、模型組、中藥組各18只。模型組、中藥組動物適應性飼養1周后進行造模手術，造模前禁食不禁水，給予2%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，開腹暴露左腎，切除腎臟的上下極及外側(共2/3腎臟組織)，1周后行右腎全切術，完成5/6腎切除手術造模，術后恢復1周后進入藥物干預治療階段。假手術組同期給予開腹手術，僅暴露腎臟不行腎臟切除，飼養方法同模型組。各組大鼠術后均未出現手術切口感染，未行抗生素預防性抗感染處理。造模成功后，給藥劑量按臨床實驗方法學計算，給予扶正化瘀降濁通絡方水煎液39.3 g/kg體質量灌胃，每日1次。模型組和假手術組給予等量清潔飲用水灌胃。

2.2 標本采集

灌胃后4周、8周、12周分別處死一批大鼠，每組每階段處死6只。末次給藥后將大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水，24 h后給予2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取全血1 mL留作流式細胞儀T細胞亞群檢測，取全血2 mL離心后分離血清，用于生化及CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA檢測。

2.3 觀察指標與檢測方法

2.3.1 大鼠一般情況觀察 動態記錄各組動物的精神狀態、活動狀態、毛發光澤度、目色、舌色、四肢情況、飲水量、二便及體質量變化。

2.3.2 生化指標檢測 采用全自動生化分析儀酶法檢測血肌酐和尿素氮水平。

2.3.3 全血T細胞亞群檢測 運用流式細胞術檢測全血T細胞亞群CD4+(%)、CD8+(%)，具體按試劑盒步驟操作。

2.3.4 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6微炎癥指標檢測 采用ELISA法檢測血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，具體按試劑盒步驟操作。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況變化

與假手術組比較，模型組的行為狀態自8周出現異常，表現為精神萎靡，喜互相抱團；外觀出現改變，可見毛色變黃、無光澤、豎起、雜亂無章，目色、耳色變淡，尿量增加，部分可見尿液渾濁；12周時活動度明顯下降，外觀可見毛色枯黃，部分大鼠自行撕咬皮毛、局部毛發斑駁、舌色紫黯、四肢腫脹等，尿量減少，大便出現干結。中藥組8周時也呈現精神萎靡，活動度下降，外觀上毛發光澤度減弱，目色、耳色變淡，但較模型組好轉，大便稀軟不成形，12周時大鼠活動度與8周相似，尿量較模型組多，大便稀軟不成型，至12周仍未見舌色紫黯且無四肢腫脹。

3.2 各組大鼠體質量變化

表1示，整個實驗過程中大鼠體質量持續增長。與假手術組比較，模型組大鼠第8周體質量下降(P<0.05)，12周時明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，中藥組第8周與第12周體質量均明顯增長(P<0.05)。

3.3 各組大鼠血肌酐和尿素氮變化比較

表1示，與假手術組比較，模型組大鼠4周、8周、12周的血肌酐與尿素氮水平均顯著升高(P<0.01)，中藥組與模型組比較，4周、8周、12周的血肌酐水平顯著下降(P<0.01)，但與尿素氮水平比較差異無統計學意義。

表1 各組大鼠體質量、血肌酐、尿素氮變化比較

3.4 各組大鼠CD4+T、CD8+T細胞比率變化

表2示，相較假手術組，模型組CD4+T細胞比率從第8周開始下降(P<0.05)，12周下降更加明顯(P<0.01)，CD8+T細胞比率在8周、12周均有升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥組同期的CD4+T細胞比率有所升高，其中以12周升高明顯(P<0.05)，表明中藥可降低12周時CD8+T細胞比率(P<0.05)。

表2 各組大鼠CD4+、CD8+細胞比率變化比較

3.5 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6變化

表3示，與假手術組比較，自4周起，模型組CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6均有明顯升高(P<0.01)，且隨病程延長逐漸上升。與模型組比較，中藥組微炎癥因子表達量均下降，其中CRP、IL-1β第8周、12周表達量均明顯下降(P<0.01)，TNF-α、IL-6第12周時表達量明顯下降(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組大鼠血清CPR、TNF-α、IL-1β、IL-6變化比較

4 討論

5/6腎切除模型是目前經典的CRF動物疾病模型[10]，主要采用手術方式造成有效腎單位減少，呈“三高”狀態(高壓力、高濾過、腎小球高灌注)，最終形成以腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質纖維化為病理特點的動物疾病模型，并伴有血肌酐、尿素氮升高、腎小球的濾過率下降等實驗室指標變化，與臨床CRF疾病發展模式非常相似，同時具備造模方式單一、簡便易行、穩定性與重復性好、干擾因素少等優勢[11]。本研究動態檢測CRF大鼠血肌酐、尿素氮情況發現，隨著病情進展大鼠血肌酐和尿素氮水平持續增長，并通過計算大鼠的腎小球濾過率進行性下降，符合CRF的診斷標準，是一種成功的西醫動物疾病模型。

中醫尚無CRF的病名，大部分醫家認為腎虛為其核心機制，常伴見肺脾心肝等多臟虛損，腎病日久，耗損正氣，正氣虧虛，推動無力，致氣機阻滯，有形之邪漸長；氣不行血，血不行常道，致血瘀脈絡；陽虛可致氣化不利，水濕停聚，絡脈阻滯，逐漸出現病理產物等內邪積聚[12],故CRF本屬“本虛標實”范疇[13]。動物基礎研究無法通過傳統的“望聞問切”對大鼠進行辨證，但從宏觀水平觀察，本實驗中模型組大鼠出現精神萎靡、喜互相抱團、活動度下降等陽氣衰弱表現。《素問·六節臟象論篇》曰：“腎者，……其華在發?！贝笫竺凕S、皮毛無光澤、毛發豎起、雜亂無章，呈現腎虛表現；大鼠目色、耳色變淡，與脾虛不能運化、氣血生化無源有關；后期大鼠出現自行撕咬皮毛，考慮與血虛風動所致；同時其舌色紫黯，考慮因陽氣無力推動，體內瘀血阻滯；其四肢腫脹，出現大便干結，考慮因脾虛、水液代謝失司所致?？梢奀RF大鼠存在脾腎虧虛和濁瘀內阻證候，系典型的“正虛邪實證”。

研究表明，肝郁脾虛、肝腎陰虛、脾腎陽虛等以虛證為主要證型的患者體內CD4+/CD8+細胞比值顯著低于正常[5]。使用百令膠囊等補腎健脾扶正類中藥，可改善T細胞免疫失調情況，提高免疫能力[14]，故可通過檢測細胞免疫功能指標(CD4+T細胞比率、CD8+T細胞比率)，反映動物正氣強弱情況。本研究發現，CRF大鼠血肌酐升高的同時，其體內CD4+T細胞比率逐漸下降，CD8+T細胞比率逐漸增高，說明大鼠的免疫功能下降，從微觀水平提示CRF大鼠有“正氣虧虛”的微觀中醫證候。

研究發現，CRF患者因腎小球濾過率下降、自由基等氧化產物清除減少,氧化抗氧化系統失衡,促進了炎癥反應,體內都存在以CRP明顯升高和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等在正常范圍內相對升高為特征的慢性炎癥狀態的炎癥反應[15]。研究發現，濕濁證患者血清CRP升高的概率是非濕濁證的4.125倍，提示濕濁證患者CRP水平高于非濕濁證患者[16]。李小會等[17]發現，濕熱證型患者TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著高于脾腎陽虛證組。李媛等[18]發現，使用健脾除濕藥物可使患者體內血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯降低，全身炎癥狀態得到改善，故可將微炎癥狀態看作是CRF“邪實證”的微觀體現[19]。本研究發現，4周時微炎癥指標出現一個小高峰，考慮與術后炎性反應所致。從整體12周觀察來看，CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥指標進行性增高，說明CRF大鼠存在微炎癥狀態，提示該模型大鼠呈現“邪實證”微觀中醫證候。

為進一步明晰該CRF大鼠的中醫證候特征，本研究運用“以方測證”原理[9]，使用臨床治療CRF“正虛邪實證”的有效驗方扶正化瘀降濁通絡方干預CRF大鼠。扶正化瘀降濁通絡方組成：生黃芪、熟地黃、酒大黃、黃芩、丹參、紅花、酒水蛭、土鱉蟲、甘草，為CRF經典方(腎康方)和《金匱要略》經方(大黃蟲丸)化裁而成，具有“通補并用，標本兼顧”之效，彌補了腎康方活血之力不足、大黃蟲丸補虛之效欠佳等缺陷，取長補短是治療慢性腎臟病“正虛邪實證”的基本方。本研究顯示，使用扶正化瘀降濁通絡方后大鼠仍精神萎靡，但活動度增加，說明陽氣得到一定補充；大鼠外觀較模型組狀態好，說明使用補益脾腎藥物后脾腎虧虛狀態得到改善；舌色紫黯情況不明顯，說明給予活血通絡藥物后體內瘀血阻滯情況有所好轉。從宏觀層面觀察，使用扶正化瘀降濁通絡方可使CRF“正虛邪實”情況得到改善。從微觀水平分析，扶正化瘀降濁通絡方治療后大鼠體內CD4+T細胞比率下降幅度減緩，CD8+T細胞比率增高幅度變慢，提示大鼠的“正虛證”情況有所改善，同時運用此方還使CRF大鼠體內CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等微炎癥指標增幅減緩，證實CRF大鼠“邪實證”情況好轉，具有“祛邪”功效，基于“以方測證”原理，可見該模型符合“正虛邪實證”。

綜上所述，5/6腎切除模型是一個經典的CRF疾病模型，同時存在免疫異常和微炎癥狀態。通過宏觀及微觀水平研究證實，其符合“正虛邪實證”，可作為進行中醫藥治療具有“正虛邪實證”CRF動物研究載體，同時可作為以“扶正祛邪”為治則的中藥復方研究的動物模型，但因實驗局限性，未能明確該模型具體的臟腑虛損和內邪種類，仍需進一步的研究與探索。