“風(fēng)寒濕致痹”理論指導(dǎo)下體內(nèi)外骨關(guān)節(jié)炎模型建立與評價研究?

沈 雪， 薛 艷， 陳 龑， 李 名， 張 琥， 曹月龍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海 201203)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是由環(huán)境刺激、機(jī)械應(yīng)力、年齡因素等導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨損傷、退變的疾病[1，2]。KOA屬于中醫(yī)學(xué)“膝痹”范疇[3]，而風(fēng)寒濕邪外襲是其致病的重要因素。《素問·痹論篇》提及風(fēng)屬陽邪，為百病之長，性能疏散，易使腠理開泄；寒濕皆屬陰邪，乘風(fēng)邪侵襲人體，引起經(jīng)絡(luò)痹阻和氣血不暢，說明風(fēng)寒濕可進(jìn)一步促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，但目前缺乏相關(guān)實(shí)驗證明。本文從實(shí)驗角度構(gòu)建風(fēng)寒濕體內(nèi)環(huán)境及風(fēng)寒濕關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)外模型，體內(nèi)實(shí)驗通過觀察軟骨組織學(xué)及檢測血清中炎癥因子表達(dá)，體外實(shí)驗通過觀察加入風(fēng)寒濕血清的軟骨細(xì)胞形態(tài)及檢測相關(guān)基因表達(dá)，證明“風(fēng)寒濕”外邪可促進(jìn)膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。本研究已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物福利與倫理委員會審查，倫理編號PZSHUTCM190322003。

1 材料

1.1 動物

體內(nèi)實(shí)驗選用SPF級5周齡雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量180～200 g，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗動物有限公司，實(shí)驗動物許可證號SCXK(滬)2013-0016。體外實(shí)驗選用SPF級新出生24 h內(nèi)的裸鼠，體質(zhì)量1.5～4 g，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗動物有限公司，許可證號碼SCXK(滬)2018-0006。

1.2 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號C0105 S)；白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司，貨號分別為RLB00，R6000B)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素試液、0.25%胰蛋白酶(Gibco，貨號分別為C11995500BT，10270106，15140-122，25200-056)；膠原酶Ⅱ型(DIYIBIO，貨號DY40126)；甲苯胺藍(lán)(Servicebio，貨號G1032)；RNA文庫構(gòu)建試劑盒(NEB，貨號E7530)。

人工氣候箱(型號LTC-1000，上海三騰儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)(型號RM2165，德國Leica公司)；石蠟包埋機(jī)(型號EG1150C，德國Leica公司)；顯微鏡(型號IX71，Olympus)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號HERA cell 150,Thermo)；酶標(biāo)儀(型號Synergy4，Biotek)；Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(型號Illumina Hiseq 4000，Agilent Technologies)。

2 方法

2.1 動物分組及模型建立

大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字分配原則分為空白組(Blank組)、膝骨關(guān)節(jié)炎組(KOA組)、風(fēng)寒濕+膝骨關(guān)節(jié)炎組(FKOA組)每組各15只。Blank組無干預(yù)措施，KOA組采用改良Hulth法(切斷大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板及切斷前交叉韌帶)建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型，F(xiàn)KOA組采用改良Hulth法+人工氣候箱(設(shè)置濕度93%～97%、溫度2～6 ℃、風(fēng)力3級)模擬風(fēng)寒濕環(huán)境因素建立SD大鼠風(fēng)寒濕型膝骨關(guān)節(jié)炎模型，連續(xù)造模4周。

2.2 細(xì)胞分組及模型建立

取新生SD裸鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離、提取及培養(yǎng)，選取第3代(細(xì)胞狀態(tài)較好)進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗分組：Control組(軟骨細(xì)胞經(jīng)20 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)炎癥成功后作為膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型)，F(xiàn)HS組(加入10% FKOA組大鼠造模成功后的血清+20 ng/mL IL-1β)。

2.3 體內(nèi)實(shí)驗檢測指標(biāo)與方法

2.3.1 HE染色 大鼠造模成功后，戊巴比妥鈉腹腔過量注射處死，用刀片切取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，4%多聚甲醛固定樣品，脫水、包埋、制作石蠟切片，HE染色后顯微鏡下觀察各組軟骨形態(tài)。

2.3.2 ELISA法檢測大鼠血清中IL-1β及IL-6含量 取大鼠腹主動脈血10 mL，按照ELISA試劑盒使用說明書檢測大鼠血清中IL-1β與IL-6的含量。

2.4 體外實(shí)驗檢測指標(biāo)與方法

2.4.1 軟骨細(xì)胞染色鑒定 當(dāng)軟骨細(xì)胞長滿至培養(yǎng)皿底部80%左右時，傳第1代軟骨細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)并傳代獲得第3代軟骨細(xì)胞，接種于6 孔板中，待細(xì)胞爬滿至50%～60%時棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗2次后，置于4%多聚甲醛中固定1 h，再用PBS洗2次后加入1%甲苯胺藍(lán)室溫放置染色10～30 min，無水乙醇沖洗至無色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

2.4.2 軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 2組軟骨細(xì)胞(第3代)給予相應(yīng)干預(yù)后分別培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.4.3 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因聚類分析 使用Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估RNA完整性，RIN值大于7認(rèn)為RNA完整性合格，每個樣品提取1.5 μg total RNA。使用RNA文庫構(gòu)建試劑盒并按照說明構(gòu)建測序文庫，并將barcode添加到每個樣品文庫序列中，Illumina Hiseq 4000平臺測序產(chǎn)生150bp的配對序列。參考基因組和基因注釋文件直接從基因組網(wǎng)站下載。使用HISAT2 v2.1.0將配對末端clean reads與參考基因組比對，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。HTSeq v0.11.2計算比對到每個基因的序列片段數(shù)量。使用FPKM值為表達(dá)水平，做層次聚類分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果

3.1.1 軟骨組織HE染色比較 圖1示，Blank組中膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列有序，軟骨表面光滑，其中表淺層、移行層、輻射層、鈣化層4層結(jié)構(gòu)清晰可見，軟骨細(xì)胞排列整齊，潮線完整(圖1A)。KOA組軟骨表面欠光滑，軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂、肥大，有細(xì)胞團(tuán)聚成簇現(xiàn)象和軟骨細(xì)胞凋亡(圖1B)。FKOA組表層軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多并伴有肥大化，出現(xiàn)空隙窩和細(xì)胞排列紊亂(圖1C)。

注：A.空白組(Blank組)，B.膝骨關(guān)節(jié)炎組(KOA組)，C.風(fēng)寒濕+膝骨關(guān)節(jié)炎組(FKOA組)

3.1.2 ELISA檢測血清IL-1β、IL-6表達(dá)比較 圖2示，通過ELISA檢測大鼠血清中IL-1β及IL-6含量，與Blank組比較，KOA組及FKOA組中IL-1β和IL-6含量均明顯升高(P<0.01)；與KOA組比較，F(xiàn)KOA組中IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，IL-6含量也均顯著升高(P<0.01)。

注：與Blank組比較：**P<0.01，與KOA組比較：#P<0.05，##P<0.01；白細(xì)胞介素(interleukin, IL)；空白組(Blank組)、膝骨關(guān)節(jié)炎組(KOA組)、風(fēng)寒濕+膝骨關(guān)節(jié)炎組(FKOA組)

3.2 體外實(shí)驗結(jié)果

3.2.1 原代軟骨細(xì)胞染色鑒定 圖3示，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色對所分離提取的軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，可見獲得的軟骨細(xì)胞核均呈深藍(lán)色，胞漿呈淺藍(lán)色。

圖3 原代軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色鑒定(×100)

3.2.2 2組軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 圖4示，Control組中軟骨細(xì)胞逐漸變成長梭狀，而加入風(fēng)寒濕血清干預(yù)后的風(fēng)寒濕組軟骨細(xì)胞則表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)改變，多為類成纖維細(xì)胞樣的扁平長梭形或不規(guī)則形。

注：A為Control組(軟骨細(xì)胞經(jīng)20 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)炎癥成功后作為膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型)，B為FHS組(加入10% 風(fēng)寒濕+膝骨關(guān)節(jié)炎組大鼠造模成功后的血清+20 ng/mL IL-1β)；白細(xì)胞介素(interleukin, IL)

3.2.3 2組軟骨細(xì)胞差異表達(dá)基因聚類分析 圖5示，選取骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因進(jìn)行聚類分析，取以2為底的對數(shù)后，利用系統(tǒng)聚類法得到聚類。圖6示，與Control組比較，F(xiàn)HS組中Ⅱ型膠原蛋白α1(collagen type II alpha 1，Col2a1)、蛋白多糖(Aggrecan，Acan)、SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-related HMG box transcription factor 9，SOX9)mRNA的表達(dá)明顯下降(P<0.01)。

注：Control組(軟骨細(xì)胞經(jīng)20 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)炎癥成功后作為膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型)，F(xiàn)HS組(加入10% 風(fēng)寒濕+膝骨關(guān)節(jié)炎組大鼠造模成功后的血清+20 ng/mL IL-1β)；白細(xì)胞介素(interleukin, IL)

注：與Control組比較：**P<0.01；Control組(軟骨細(xì)胞經(jīng)20ng/mL IL-1β誘導(dǎo)炎癥成功后作為膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型)、FHS組(加入10% 風(fēng)寒濕+膝骨關(guān)節(jié)炎組大鼠造模成功后的血清+20 ng/mL IL-1β)；白細(xì)胞介素(interleukin, IL)；Ⅱ型膠原蛋白α1(Collagen type II alpha 1，Col2a1)，蛋白多糖(Aggrecan，Acan)，SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-related HMG box transcription factor 9，SOX9)

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”“骨痹”范疇。《素問·痹論篇》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹”“不與風(fēng)寒濕氣合，故不為痹”。風(fēng)寒濕邪外襲是致病的重要因素，對2027篇文獻(xiàn)中所提及的骨關(guān)節(jié)炎證型進(jìn)行分析后顯示，風(fēng)寒濕痹為較常見的證型，其提取的病性證素也以風(fēng)、寒、濕比例最高[4]。本實(shí)驗證明，風(fēng)寒濕外界因素會導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)一步加重，說明風(fēng)、寒、濕外界因素在膝骨關(guān)節(jié)炎中的重要性。

首先課題組采取使用較多的改良Hulth法進(jìn)行造模[5-7]，并采用人工氣候箱模擬風(fēng)寒濕環(huán)境構(gòu)建風(fēng)寒濕型膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型[8]。觀察大鼠軟骨組織染色發(fā)現(xiàn)，風(fēng)寒濕外界因素促進(jìn)了關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步發(fā)展。并且通過ELISA實(shí)驗對大鼠血清中關(guān)鍵炎癥因子IL-1β和IL-6進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)風(fēng)寒濕外界因素確實(shí)可以進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)。

課題組進(jìn)一步通過分離提取經(jīng)過風(fēng)寒濕外界因素干預(yù)的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清干預(yù)原代軟骨細(xì)胞，觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)加入風(fēng)寒濕血清干預(yù)后的風(fēng)寒濕組軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)改變，多為類成纖維細(xì)胞樣的扁平長梭形或不規(guī)則形，說明風(fēng)寒濕血清可以影響軟骨細(xì)胞學(xué)形態(tài)。

為驗證風(fēng)寒濕血清確實(shí)對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的影響，課題組又進(jìn)行了基因組測序，通過觀察軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原及蛋白聚糖以及與維持軟骨細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HS組Col2a1、Acan、Sox9 mRNA的表達(dá)明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)風(fēng)寒濕血清促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的退變。

風(fēng)寒濕痹證相關(guān)體外研究的文獻(xiàn)較少，主要是以先制造動物模型來提取相關(guān)組織細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗[9-11]，但是存在提取軟骨組織樣本個體性差異大、結(jié)果數(shù)據(jù)不穩(wěn)定等問題。為減少此類問題，本研究基于動物實(shí)驗證實(shí)“風(fēng)寒濕”因素會顯著升高大鼠體內(nèi)血清炎癥因子含量，并嘗試提取風(fēng)寒濕組大鼠血清對軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。通過進(jìn)行風(fēng)寒濕動物模型造模、提取其血清加入軟骨細(xì)胞、模擬風(fēng)寒濕體內(nèi)環(huán)境達(dá)到造模的目的，保證了體外實(shí)驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。

總而言之，本研究從體內(nèi)外角度證明“風(fēng)寒濕”因素對于膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，開創(chuàng)了一條制備風(fēng)寒濕細(xì)胞模型的新方法，為今后研究外界環(huán)境因素對膝骨關(guān)節(jié)炎的影響提供了新的實(shí)驗基礎(chǔ)與方法，為“風(fēng)寒濕致痹”這一中醫(yī)病因病機(jī)理論提供了實(shí)驗依據(jù)。