雙參活血顆粒對PI3K/Akt/mTOR信號通路介導急性心肌梗死大鼠自噬的影響?

張嘉敏， 楊 鶯

(1.遼寧中醫藥大學， 沈陽 110847； 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院， 沈陽 110032)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內具有較高發病率和死亡率的疾病之一[1]。自噬是真核生物細胞中普遍存在的一種生理現象，是機體在營養缺乏或應激條件下發生的適應性反應，在多重壓力下自噬通過清除細胞內無用大分子蛋白和受損細胞器，降解多余產物以維持細胞內狀態的穩定，完成對細胞內營養的供給，滿足機體新陳代謝需要。此外，自噬還具有參與多種人類疾病發展過程的生物功能[2]。適當的心肌細胞自噬被證實可減輕心肌重構，維護正常的心功能，應對急性缺血缺氧等有害刺激以及保護受損心肌細胞，使其避免發生急性缺血性死亡；異常的自噬可增加心肌細胞死亡風險，加速心肌梗死的進程甚至加重心力衰竭[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路在心肌細胞自噬調控中發揮著至關重要的作用[4]。根據心肌梗死發生時的表現特點，其屬于中醫學“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范疇，某些益氣活血藥可通過抑制自噬的過度表達，保護缺血缺氧狀態下的心肌細胞防治缺血性心臟病[5]。本文通過動物實驗探討以益氣養陰、活血通脈功能為主的雙參活血顆粒對PI3K/Akt/mTOR信號通路介導的急性心肌梗死大鼠心肌自噬的影響，為臨床中醫藥調控自噬治療心血管疾病的研究提供參考。本研究已通過遼寧中醫藥大學動物倫理委員會審查，批號21000092019041。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質量300～340 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號SCXK(遼)2015-0001。飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，無菌飲水及飼料清潔級喂養7 d，適應環境后進行心肌梗死大鼠模型制備。

1.2 藥物

雙參活血顆粒藥物組成：人參10 g，黃芪20 g，麥冬15 g，當歸15 g，丹參15 g，川芎20 g，桃仁15 g，紅花15 g。采用傳統顆粒制備方法，由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室提供。鹽酸曲美他嗪片由施維雅(天津)制藥有限公司生產，20 mg/片，國藥準字20055465。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號WLA004)、ECL檢測試劑盒(貨號WLA003)、β-actin(WL01845)、PI3K(WL02240)、Akt(WL0003b)、mTOR(WL02477)、p-Akt(WLP001a)、p-mTOR(WL03694)抗體，購自沈陽萬類生物科技有限公司；p-PI3K抗體(貨號AF3241)，中國Affinity公司。

DYY-7C型電泳儀(北京六一公司)；H-2050R型超速冷凍離心機(湖南湘儀公司)；ELX-800型酶標儀(美國BIOTEK公司)；DH36001B型電熱恒溫培養箱(天津泰斯特公司)；HL-B6型小動物呼吸機(北京新利科技有限公司)；MAC1200ST型心電圖機(美國GE公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥

采用隨機數字表法將60只大鼠分為正常組(0.9%氯化鈉溶液3 mL/次)8只和造模組52只，造模成功后存活40只隨機分為模型組(0.9%氯化鈉溶液3 mL/次)、西藥組(鹽酸曲美他嗪片1.90 mg/kg)、中藥高劑量組(7.92 g/kg)、中藥中劑量組(3.96 g/kg)、中藥低劑量組(1.98 g/kg)每組各8只，用藥劑量按照動物體表面積換算，造模成功后次日上午8時開始灌胃給藥，每日1次，分籠飼養，自由飲食飲水，共連續觀察2周后處死。

2.2 模型制備方法

造模大鼠禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉成功后仰臥位固定，氣管插管連接小動物呼吸機，針狀電極插入四肢連接心電監測儀，術中記錄大鼠標準Ⅱ導聯心電圖。鈍性分離胸骨左緣肌肉組織后，于胸骨左側第3肋間逐步剪開肋間肌暴露心臟，在左心耳下緣2～3 mm處結扎冠狀動脈左前降支,以Ⅱ導聯心電圖ST段明顯抬高>0.1 mV至少15 min為造模成功標志(圖1)。迅速將心臟送回胸腔,確認無出血后依次縫合胸壁，抽出胸腔積氣積液，待大鼠恢復自主呼吸后停止呼吸機，送回鼠籠繼續飼養。

圖1 造模前后大鼠Ⅱ導聯心電圖變化

2.3 指標檢測與方法

Western Blot法檢測自噬信號通路相關蛋白表達:取各組大鼠缺血心肌組織加入裂解液，冰上靜置5 min，離心后取上清，采用BCA比色法定量檢測蛋白含量。分別配置8%、10%、12%、15%的分離膠進行電泳，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，封閉結束后漂洗，與相應的PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶1000)、Akt (1∶500)、p-Akt(1∶500)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、β-actin(1∶1000)一抗反應，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次，加二抗(1∶5000)37 ℃孵育45 min，TBST充分漂洗后ECL曝光，采用凝膠圖像處理系統Gel-Pro-Analyzer軟件對目的條帶進行灰度分析，各組與內參β-actin比較得出相對光密度值。

2.4 統計學方法

3 結果

圖2表1示，與正常組比較，模型組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，PI3K、Akt、mToR蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，各藥物組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平均明顯上調(P<0.05)，其中西藥組上調最為顯著，中藥低、中、高劑量組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達具有劑量依賴性，PI3K、Akt、mTOR蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心肌組織中PI3K 、Akt、mTOR及磷酸化蛋白表達灰度值比較

注：A.正常組；B.模型組；C.中藥高劑量組；D.中藥中劑量組；E.中藥低劑量組；F.西藥組；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)，蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)

4 討論

冠狀動脈堵塞是造成心肌梗死的主要原因，這種堵塞致使冠狀動脈血流供應減少，持續性缺血缺氧，從而引起心肌功能損傷和不可逆的壞死，嚴重威脅患者的生命安全。近年來，中醫藥調控自噬治療心血管疾病相關研究日漸廣泛，多種中藥活性成分、多條信號通路被發現，并可參與自噬的調控機制[6]。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是調控自噬最為經典的通路。PI3K根據結構的不同主要分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型PI3K是觸發mTOR通路的必要環節，發揮激活mToR蛋白而抑制自噬的作用；Ⅱ型PI3K不作為細胞表面受體下游的經典信號轉導子，具體功能尚存在爭議；Ⅲ型PI3K則具有可與多種蛋白結合組成復合體共同參與細胞自噬的功能[7]。Akt是

一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，共有Akt1、Akt2、Akt3 3種亞型，屬于AGC蛋白激酶家族。Akt是PI3K下游的主要作用靶點，活化后的Akt處于PI3K/Akt/mTOR信號通路的核心位置，在細胞生長、存活、代謝等多種生物學過程中發揮關鍵作用[8]。mTOR通過形成mTORC1、mTORC2 2個不同的復合物發揮作用，mTORC1可通過影響S6K1等下游效應因子的磷酸化，參與細胞代謝、生長、增殖、分化和自噬的調控[9]。PI3K/Akt/mTOR信號通路在自噬過程的不同階段可發生相應變化，生理情況下細胞內營養充足，各種細胞因子等信號分子首先與酪氨酸激酶受體結合，進而激活I類PI3K，之后進一步磷酸化PIP2生成PIP3,活化的PIP3作為第二信使將Akt從細胞質聚集至細胞膜，而不能直接磷酸化Akt，需與磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1 (phosphoinositide dependent protein kinase1, PDK1)結合，從而促使Akt磷酸化，p-Akt可直接或間接將信號傳至mTOR[10]。mTOR是細胞自噬進程中的主要抑制因子，受PI3K/Akt通路的正向調控，mTOR收到上游激活信號后形成mTOR復合物1(mTOR Complex 1, mTORC1)，激活的mTORC1通過一系列調控，抑制自噬啟動因子的活性，發揮抑制自噬的生理效應，即PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，可抑制自噬進程[11]。而當細胞受到營養缺乏、缺血、缺氧、氧化應激等不利因素的刺激時，均會抑制PI3K/Akt/mTOR通路中多種激酶的磷酸化，誘導細胞發生自噬[12]。

正常情況下的心肌細胞內存在著較低水平的自噬，當心肌細胞處于急性缺血缺氧狀態時，受營養缺乏和氧化應激的影響，細胞的自噬水平會適應性上調，從而減輕心肌細胞的損傷，但長期過度的自噬可能通過自我消化加劇心肌細胞的死亡[13]。目前自噬現象對缺血心肌細胞發揮保護作用的具體時間窗尚不明確。

中醫認為胸痹的本質是本虛標實，在心肌梗死的中醫證型分類中,虛證類最為常見的證型依次為氣虛、陰虛、陽虛等,而實證類以血瘀、痰濁最為多見,其次是氣滯、寒凝等，所以氣虛、陰虛、血瘀和痰濁是心肌梗死的主要病理基礎，益氣養陰、活血通脈為胸痹的主要治療原則[14]。本實驗選用雙參活血顆粒，由人參、黃芪、麥冬、當歸、丹參、川芎、桃仁、紅花8味藥物組成。方中人參大補元氣為君藥，臣以黃芪助人參益氣;麥冬滋養心肺；當歸補血行血，為血中之氣藥；丹參、川芎、桃仁、紅花活血化瘀、通脈止痛共為佐藥，諸藥共奏益氣養陰、活血通脈之功，正切合病機。人參皂苷、丹參酚酸B、川芎嗪、黃芪總苷、麥冬皂苷分別是中藥人參、黃芪、丹參、川芎、麥冬的主要活性成分。現代藥理研究表明，這些具有益氣活血的中藥有效成分能夠參與自噬相關信號蛋白的調控，并對心肌有保護作用。Qin等[15]研究發現，人參皂苷可通過PI3K/Akt/mTOR通路保護受缺氧誘導的損傷心肌細胞。丹參酚酸B能夠促進自噬標志蛋白微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(Microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ、LC3-Ⅱ)和自噬效應蛋白(Beclin-1)的表達，在急性心肌梗死中發揮著至關重要的保護作用[16]。孫達[17]等認為，川芎嗪能夠激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/缺氧誘導因子-1α(Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B/Hypoxia Inducible Factor-1α, PI3K/AKT/HIF-1α)信號通路，改善大鼠急性心肌梗死后心功能損傷和減少心肌細胞死亡。沈瑩等[18]通過實驗發現，黃芪總苷可通過mTOR信號通路抑制細胞自噬,減輕H2O2誘導的大鼠心肌細胞氧化應激損傷，提高心肌細胞存活率。本研究采用“冠狀動脈左前降支結扎法” 成功復制大鼠心肌梗死模型后，模型組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達降低，提示機體產生保護性應激反應后抑制此條信號通路活化，誘導心肌細胞自噬；經鹽酸曲美他嗪、雙參活血顆粒干預后，各藥物組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯增高，且雙參活血顆粒的干預劑量與蛋白表達結果呈正相關，提示雙參活血顆粒可上調PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平，激活心肌梗死大鼠心肌細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制自噬，并隨給藥劑量的增加該通路被激活程度越高。

綜上所述，雙參活血顆粒可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制過度自噬，從而減輕大鼠心肌梗死晚期損傷。本實驗存活大鼠數量較少，未能實時、定量的檢測各組心肌細胞自噬活性變化，缺少反映自噬活性對于心肌細胞影響的可靠指標，雙參活血顆粒如何調控PI3K/Akt/mTOR信號通路介導的自噬以及在心肌梗死中發揮作用都有待進一步研究證實。尋找中醫藥調節自噬有效靶點，明確中醫藥如何通過激活適度自噬，抑制過度自噬而減少自噬性死亡的機制，明確細胞自噬在AMI中的具體時間窗，把握自噬水平高低與治療作用的關系，將為中醫藥調控自噬治療心血管疾病提供新的前景。