清肺飲調節TLR4/NF-κB炎癥信號通路治療細菌性肺炎的作用機制?

孫曉舟， 徐 炎， 王丹丹， 孔一卜， 郭婷婷， 郭 磊， 楊文波， 孫麗平△

(1.長春中醫藥大學， 長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院， 長春 130021)

細菌性肺炎是一種多發于春秋季節的感染性疾病，是5歲以下兒童死亡率最高的疾病之一，也是導致兒童住院的常見原因[1]。針對病原體應用抗生素是臨床治療的主要策略，其臨床效果值得肯定，但隨之而來的抗生素濫用與耐藥難題備受關注[2]。本病屬于中醫學肺炎喘嗽、溫熱病等范疇。清肺飲是國醫大師王烈教授基于“熱毒”理論[3]治療兒童肺炎喘嗽(風熱郁肺型)的經驗方，由黃芩、射干、連翹等藥物組成，臨床以本方加減治療兒童風熱郁肺型肺炎喘嗽60余年，療效顯著。有研究表明，包括黃芩在內的多種中藥具有良好的抗菌作用[4，5]，但以黃芩為君藥的復方在抗菌作用機制方面研究較少。

細菌性肺炎的早期發病機制主要以炎癥反應為主，Toll樣受體4(toll-like receptors, TLR4)相關信號通路是激活炎癥反應的重要途徑[6]，核因子κB(nuclear factor kappa-B、NF-κB)是啟動炎癥反應的關鍵過程[7]。本研究分別從體內和體外實驗探討清肺飲在肺炎發病過程中的作用，探討其在TLR4/NF-κB炎癥信號通路方面的作用機制，為臨床推廣應用提供依據。本研究已通過長春中醫藥大學倫理委員會審查，倫理學批號20190116。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康4～6周齡雌性Balb/c小鼠36只，體質量(20±2) g，購自長春中醫藥大學動物學中心，實驗動物許可證號SYXK(吉)2018-0014。動物在溫度20～26 ℃、相對濕度40%～70%的潔凈動物房內適應性飼養5 d。

1.2 細胞

人非小細胞肺癌細胞系(A549細胞)(貨號SCSP-503)，購自上海中國科學院細胞庫。

1.3 藥物及制備

清肺飲顆粒藥物組成：連翹、黃芩、射干等，購于長春中醫藥大學附屬醫院，用溫開水沖勻供小鼠灌胃；清肺飲溶液凍干濃縮成粉末，需要時用二甲基亞砜溶解用于細胞實驗。注射用頭孢曲松鈉1.0 g溶于純水中，購于臺灣泛生制藥廠股份有限公司，貨號H20100294；肺炎鏈球菌D39菌株(遵義醫學院惠贈)。

1.4 主要試劑與儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(貨號10099141)，美國Gibco公司；THB培養基(貨號LA18600)，北京索萊寶科技有限公司；25%胰蛋白酶(貨號C0202)，上海碧云天公司；1640培養基(貨號SH30096.LS)，美國Hyclone公司；噻唑藍(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromid，MTT)(貨號ST316)，上海碧云天公司；TLR4兔單克隆抗體、NF-κB p65兔單克隆抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)兔單克隆抗體、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκBα)、兔多克隆抗體、髓樣分化因子(myeloiddifferen-tiationfactor88，MyD88)、兔多克隆抗體、β微管蛋白(β-Tubulin)鼠單克隆抗體(1∶1000稀釋)、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)，abcam，貨號分別為ab22048、ab16502、ab194726、ab7217、ab219413、ab18207、ab150077、ab150113。蘇木精、伊紅染色液，阿拉丁公司(貨號H104306)；小鼠白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor Necrosis factorα，TNF-α)ELISA試劑盒(貨號分別為M6000B、MLB00C、MTA00B)，美國R&D公司。

超凈工作臺(型號SW-CJ-1FB)，蘇州凈化公司；細胞恒溫培養箱(型號BC-J160S)，上海博迅公司；純水系統(型號WP-UPS-45)，沃特爾公司；蛋白電泳儀(型號Power Pac HC)，bio-rad公司；分子成像系統(型號Fxpor lius)，上海bio-rad公司。

2 方法

2.1 小鼠肺炎鏈球菌肺炎模型建立及分組給藥

參照文獻報道,選擇肺炎鏈球菌D39菌株，37 ℃下在THB培養基中培養，直至OD 600 nm達到0.4(對數中期)，離心半徑8 cm，1000 r/min離心10 cm[8]。PBS洗滌3次，獲得肺炎鏈球菌菌液。室溫環境下適應性飼養小鼠5 d后，按隨機數字表法分為對照組、模型組、清肺飲低劑量組、清肺飲中劑量組、清肺飲高劑量組和頭孢曲松組6組各6只，對照組小鼠在正常條件下飼養，其余組小鼠均經左鼻滴入1×108CFU/mL肺炎鏈球菌菌液25 μL，建立肺炎鏈球菌感染模型。按照人體與小鼠體表面積換算比例，將清肺飲復方臨床用量換算為小鼠用量，清肺飲低劑量組0.21 g/kg、清肺飲中劑量組0.42 g/kg、清肺飲高劑量組0.84 g/kg，灌胃給藥每次200 μL，每日2次；25 mg/mL頭孢曲松液皮下注射20 μL，每日1次；48 h后乙醚麻醉，脫頸處死各組小鼠取材。

2.2 HE染色檢測小鼠肺組織炎癥改變

取材當天將小鼠肺組織浸入4%多聚甲醛內固定，石蠟包埋，切片厚度為3 μm，脫蠟至水，蘇木精、伊紅染色，脫蠟、透明、封片。為對肺部炎癥和損傷進行評分，對整個肺表面進行以下參數分析，如間質損害、血管炎、支氣管炎、水腫、血栓形成和胸膜炎。每項參數的評分標準為0～4(0：無；1：輕度；2：中度；3：嚴重；4：非常嚴重)[9，10]，顯示肺炎癥狀的肺表面百分比按0～5進行評分和分級(0：無；1∶5%～20%；2:21%～40%；3:41%～60%；4:61%～80%；5:81%～100%。肺部炎癥總分為每項參數的得分之和，可達到的最高得分為24分[11]。

2.3 ELISA法檢測肺泡灌洗液中炎癥因子表達

小鼠頸部中線切口暴露氣管，通過滴注和回收2份0.5 mL無菌等滲0.9%氯化鈉溶液收集支氣管肺泡灌洗液[11]。收集的肺泡灌洗液在離心半徑8 cm，3000r/min離心10 cm，取上清于-80 ℃冰箱凍存，用ELISA試劑盒檢測炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平。

2.4 細胞培養及體外炎癥模型的建立

選用A549細胞進行體外實驗，用1640完全培養基(含10%FBS)于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，每3 d進行一次傳代。細胞懸液以3×103個/孔密度接種于6孔板中，細胞貼壁后分別加入2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL脂多糖(Lipopol-ysaccharide，LPS)作用1 h，Western Blot法檢測NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα蛋白表達水平，篩選最佳LPS濃度建立穩定的炎癥損傷模型。

2.5 MTT法檢測清肺飲對A549細胞存活率的影響

將細胞懸液以3×103個/孔密度接種于96孔板，同時加入0 μg/mL～1000 μg/mL不同濃度清肺飲樣品，培養48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT液于37 ℃孵育4 h，隨后加入100 μL裂解液/孔，24 h后在酶標儀490 nm下測光密度值(optical density，OD)，計算細胞存活率，實驗重復3次。

2.6 Western Blot法檢測炎癥信號通路相關蛋白的表達

用含有1/100 PMSF的裂解液研磨提取細胞全蛋白進行蛋白制樣，按每孔30 μg蛋白在10% SDS-PAGE中分離，采用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，分別孵育TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα及β-Tubulin抗體4 ℃過夜，TBST洗滌3次后，山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗孵育1 h，再次TBST洗滌3次，采用分子成像系統進行顯影，采用Quantity-One軟件分析目的條帶OD值，以β-Tubulin為內參，以目的蛋白OD值/內參蛋白OD值反映目的蛋白相對表達水平。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 清肺飲減輕肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織炎癥損傷

通過對各組小鼠狀態進行觀察記錄發現，感染12 h后，模型組小鼠開始出現活動量少、背毛、不愛進食等情況；與模型組比較，經清肺飲和頭孢曲松治療后的小鼠活動量、進食正常，僅少數小鼠出現背毛情況。取材后肉眼觀察(圖1A、圖1C)模型組小鼠肺組織顏色明顯加深，呈暗紅色，肺葉充血腫脹，尤以左肺下葉顯著；清肺飲低劑量組小鼠肺組織顏色仍呈暗紅色，肺葉充血、腫脹；清肺飲中、高劑量組和頭孢曲松組小鼠肺組織顏色接近鮮紅，充血、腫脹不明顯。HE染色結果顯示(圖1B、圖1D)，對照組小鼠的肺泡和肺支氣管結構正常；模型組小鼠肺間質彌漫性出血，出現以多葉分核細胞和中性粒細胞為主的炎癥細胞，在細支氣管管腔中有壞死脫落的上皮細胞，肺泡壁大面積增厚，肺泡壁毛細血管擴張、充血、破裂，紅細胞外溢，肺泡及支氣管腔內見大量紅細胞滲出和炎性滲出物，與對照組比較肺組織炎癥評分明顯升高(P<0.01)；清肺飲低劑量組肺泡壁較厚，肺泡間隔較寬，肺泡壁見少量毛細血管擴張充血，有炎性細胞浸潤，但支氣管腔內未見大量的炎性滲出物；清肺飲中、高劑量組和頭孢曲松組炎癥減輕，肺泡結構較完整，肺泡壁薄，僅少量炎性細胞浸潤，且與模型組比較肺組織炎癥評分降低(P<0.01)。

注：與對照組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01；A、C.肉眼觀察肺組織顏色和形態；B、D.各組肺組織HE染色結果(≤為原始放大40倍，比例尺：20 μm)；E.肺組織炎癥評分，n=6

3.2 清肺飲降低小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子含量

通過ELISA法檢測小鼠肺泡灌洗液內炎癥因子含量(見表1)，發現模型組IL-6、IL-1β、TNF-α含量較對照組顯著增多(P<0.01)；清肺飲中、高劑量組和頭孢曲松組IL-1β、TNF-α含量較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達情況比較

3.3 不同濃度LPS對A549細胞炎癥反應的影響

LPS能夠誘導A549細胞發生炎癥反應[12]。本部分為篩選誘發炎癥反應的LPS最佳造模濃度，選用0 μg/mL～10 μg/mL LPS刺激A549細胞1 h，Western Blot結果顯示(見圖2)，與對照組比較，10 μg/mL LPS 刺激的A549細胞內p-NF-κB p65蛋白上調明顯(P<0.01)，NF-κB p65抑制蛋白IκBα明顯下調(P<0.01)，因此選用10 μg/mL LPS作為體外炎癥造模條件。

注：A.Western Blot 法檢測炎癥蛋白p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα表達水平；B、C.各蛋白表達量化結果(n=3)；與LPS 0μg/mL組比較:*P<0.05，** P<0.01；核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκBα)

3.4 清肺飲對A549細胞存活率的影響

MTT法檢測清肺飲對A549細胞存活率的影響(見圖3)，100 μg/mL、200 μg/mL濃度的清肺飲對A549細胞存活率有明顯的抑制作用(P<0.01)；濃度低于50 μg/mL的清肺飲對細胞存活率幾乎無影響(P>0.05)。

注：A.清肺飲作用于A549細胞48 h; B.清肺飲作用于A549細胞72h；** P<0.01

3.5 清肺飲對A549細胞TLR4/NF-κB炎癥信號通路的調控

清肺飲干預A549細胞24 h，再經10 μg/mL LPS造模1 h，應用Western Blot法檢測炎癥相關蛋白表達情況。圖4示，與對照組比較，模型組炎癥蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65表達上調，IκBα蛋白表達量下降至對照組的47%(P<0.01)，差異有統計學意義；與模型組比較，清肺飲干預后TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達下調，IκBα蛋白表達上調，其中清肺飲高劑量組對TLR4通路蛋白的干預最為

注：圖4-A.Western Blot法檢測A549細胞中炎癥蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα表達水平；B、C.各蛋白表達量化結果(n=3)；與對照組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκBα)、髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)、Toll樣受體4(Toll-like receptors, TLR4)

顯著(P<0.01)；頭孢曲松組TLR4、NF-κB蛋白表達下調(P<0.05，P<0.01)，IκBα蛋白表達量上調至模型組的2.4倍(P<0.01)，差異有統計學意義。

4 討論

肺炎是嚴重的全球健康問題[9,13]，全世界每年有超過200萬的5歲以下兒童因肺炎死亡，死亡率高達20%[1]，其危害甚至可能超過了癌癥、糖尿病、艾滋病。感染性因素是導致肺炎的主要原因，而細菌、病毒、支原體等微生物是引起感染性肺炎的主要誘因[1,14]。自上世紀磺胺類藥物和青霉素問世以來，抗生素作為細菌感染性疾病的首選藥物[15]，其中頭孢曲松作為第三代頭孢菌素在細菌性肺炎的臨床及基礎研究中廣為應用[16-19]。但不合理用藥及耐藥現象日益突出，2015年10月世界衛生組織發布的《全球抗菌藥物耐藥性監測系統(GLASS)報告》數據提示，其已成為威脅人類健康的重大公共衛生問題，加強耐藥菌感染的治療問題亟待解決[2,20]。

中醫藥治療感染性和傳染性疾病療效確切。古今文獻已有大量中醫藥治療感染性疾病的記載[21-24]，中醫藥的抗菌作用逐漸成為研究熱點，其作用機制和靶點有待深入研究。

細菌性肺炎以肺熱為主要病機[25]，痰、熱、毒為其病理產物，乃因熱邪犯肺、肺失宣降、臟腑功能失調、肺氣郁閉所致[26]。王烈認為，六淫之邪皆為毒邪，并提出“無毒不發熱，熱因毒而起”的“熱毒”理論[3]，指出“熱毒”是細菌性肺炎的主要病因及主癥表現。此處之“熱毒”乃是基于“有一分內熱便有一分外感”“無毒不生熱”等認識，闡述一系列熱病或熱癥并非單指溫病中之溫毒[27，28]。清肺飲就是王烈基于“熱毒”理論所創立的經驗方，臨床實踐多年效果顯著。全方均為寒涼之品，方中黃芩為君藥，擅瀉肺火、清肺熱。現代研究已表明，黃芩及其單體對葡萄球菌、溶血性璉球菌、肺炎鏈球菌等有抑制作用，且抗炎抗變態反應機制明確[22,29]；連翹為臣藥，可疏散風熱、清熱解毒；射干清熱解毒、消炎散結。全方以清瀉肺熱、清熱解毒為主，用于治療細菌、病毒感染等引起的小兒肺炎，故取其名曰“清肺飲”。

肺炎鏈球菌作為細菌性肺炎的常見致病菌，廣泛定植于人鼻咽部，攜帶率為27%～85%[30]。本研究選擇感染率高的肺炎鏈球菌作為致病菌建立肺炎小鼠模型。從HE染色的病理結果顯示，模型組小鼠肺間質彌漫性出血，肺泡壁大面積增厚，肺泡、支氣管腔內可見大量紅細胞滲出和炎癥細胞浸潤；清肺飲和頭孢曲松治療后肺間質及肺泡毛細血管擴張、出血、炎癥細胞浸潤程度均減輕，炎癥因子IL-1β、TNF-α表達含量及肺炎癥評分降低。由此可見，本研究從體內實驗驗證了清肺飲可減少小鼠肺組織炎性浸潤，減輕肺炎鏈球菌引起的炎癥反應，達到與頭孢曲松相似的抗肺炎療效。既往大量研究中都將LPS作為經典的體外炎癥模型[31-33]，LPS作為大多數細菌外璧層中產生的內毒素，可與一種重要的非特異性免疫蛋白分子Toll樣受體結合[34]。TLR4識別LPS后發生活化，通過MyD88激活絲氨酸/蘇氨酸激酶，誘導抗微生物防御系統產生IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥細胞因子，加重炎癥反應[35]；此外，TLR4還會激活與炎癥反應有關的NF-κB和蛋白激酶磷酸酶家族等活化反應。NF-κB作為啟動炎癥反應的關鍵蛋白，當與其抑制蛋白IκBs聯合時使空間構象發生改變，IκB蛋白激酶磷酸化，磷酸化的IκBs發生泛素化降解，使NF-κB從NF-κB-IκBs復合物中解離出來進入細胞核內，誘導炎癥反應發生[36]。p65是NF-κB的亞基，炎癥反應狀態下活化入核是炎性損傷程度的標志物。IκBα作為IκBs家族的主要成員，其蛋白表達降低表示炎癥通路激活[7,37]。由此本研究基于此炎癥通路進行Western Blot實驗，研究結果表明10 μg/mL LPS刺激A549細胞1 h，NF-κB p65蛋白表達上調明顯，IκBα蛋白表達下調，故選擇10 μg/mL LPS刺激A549細胞1 h為急性炎癥損傷體外造模條件。基于細胞水平進行清肺飲干預后，炎癥信號通路相關蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達下調，IκBα蛋白表達升高，尤以清肺飲高劑量組差異顯著。因此提示，清肺飲可通過抑制NF-κB的活性，調控LPS誘導的炎癥反應起到抗炎作用。

綜上所述，基于國醫大師王烈“熱毒”理論所擬的清肺飲，可減輕肺炎鏈球菌感染引起的小鼠肺組織病理損傷，減少炎癥因子的分泌，可通過調控TLR4/NF-κB信號通路起到抗炎的生物學功效。今后將對清肺飲多組學、多靶點的作用機制進行更為深入系統的研究與探討，為中醫藥治療肺部感染性疾病提供新思路，為指導臨床提供實驗基礎。