針刺結合亞低溫對腦缺血再灌注損傷大鼠腦缺血側海馬區差異miRNA功用及miR-106b-5p表達的影響?

鄭慧娥， 田浩梅， 何灝龍， 陳芯儀， 高音來， 陳楚淘

(湖南中醫藥大學針灸推拿學院， 長沙 410208)

腦血管病屬于全球范圍的高危疾病之一，具有高發病率、高致殘率、高致死率及高復發率等特點，給人類帶來諸多危害，包括身心危害、經濟損失及社會關系損害等[1]。其中缺血性腦血管病約占腦血管病的4/5[2]，救治后可繼發腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)。CIRI主要病理表現為腦水腫及神經元損傷[3]，臨床常以認知障礙、運動失調及感覺失靈為主要癥狀[4]，因此尋求安全有效的治療方法對CIRI有重要意義。

中醫治療腦卒中多以針刺聯合他法治療為多，且聯合治療效果往往更佳。針刺具有“簡便廉驗”等特點，是治療腦血管病的常用治法[5]。亞低溫是唯一被臨床證實具有改善患者生存率及神經功能預后的治療方法[6]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)高度保守且不具編碼作用，長度約為22個核苷酸，其分布范圍非常之廣包括動植物及人類等，且功能涉及到細胞的增殖分化、凋亡、分裂以及器官發育等[7]。此外有研究證實，miRNA種類及表達量于再灌注期間處于動態變化，可見miRNA與缺血再灌注的演變是相關的[8]。miR-106b-5p是miRNA成員之一，具有調節細胞凋亡及細胞增殖等功能[9]，且前期多認為它是疾病診斷的重要因子[10，11]，然鮮有干預miR-106b-5p防治疾病的文獻報道。本研究應用針刺與亞低溫相結合的方法，通過探討針刺結合亞低溫法對CIRI大鼠缺血側海馬區差異miRNA功用及miR-106b-5p表達的調控作用，以期豐富針刺聯合治療腦缺血再灌注損傷機制研究，為臨床治療提供實驗依據。本研究已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，批準號20140403。

1 材料與方法

1.1 動物

90只雄性SD大鼠，體質量(265±15) g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(湘)2013-0004。飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物實驗中心常溫環境中，適應性飼養1周左右，確保自然光暗周期，濕度約60%。

1.2 主要試劑及儀器

4%多聚甲醛(維爾生物，WB0401)；1.5%TTC溶液(維爾生物，C19H15)；DEPC水(維爾生物，WB0006) ；miRNeasy Kit(Qiagen, 217004)；miRCURYTM芯片標記試劑盒(Exiqon公司，208032-A)；Trizol(美國Invitrogen 公司，15596026)RT-PCR試劑盒(美國ABI公司，4334973)。

線栓(北京西濃科技，A4-263650)；肛溫溫度計(北京冀諾泰，JNT-LGJ)；數位溫度表(臺灣泰仕，TES1310)；熒光定量RCP儀(Thermo公司，PIKO REAL 96)；熒光定量PCR板(Thermo公司，SPL0960)。

1.3 動物分組及造模

90只大鼠按照隨機數字表法分為正常組15只、假手術組15只和造模組60只，假手術組僅插入線栓，不栓塞右側大腦中動脈(middle cerebral artery, MCA)。造模組60只大鼠參照Zea Longa[12]改良線栓法，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g體質量)麻醉后，給予頸部正中喉結旁作約10 mm切口，暴露頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(extra carotid artery, ECA)和頸內動脈(inner carotid artery, ICA)。依次對CCA近心端及ECA近分叉口處進行結扎，于CCA遠心端做微小切口，并沿此切口經CCA-ICA路徑插入線栓約18 mm，以黑色標記點過ECA和ICA分叉起始點并感受阻力為度，栓塞右側MCA制備缺血模型，局部噴灑青霉素，縫合頸部正中切口并將線栓尾部固定于皮膚上。缺血2 h后(約90 min蘇醒)小心拔出線栓即完成CIRI模型。所有大鼠于缺血再灌注后2 h行神經功能癥狀缺損評分：無神經功能癥狀缺損記0分；提尾見栓塞動脈對側前肢屈曲記1分；行走見向栓塞動脈對側旋轉記2分；行走見向栓塞動脈對側傾倒記3分；術后失去意識者記4分。造模組1～3分大鼠納入實驗，并采取相同實驗方法對缺失大鼠進行補齊。至此，造模組60只大鼠再次按照隨機數字表法依次分為模型組、亞低溫組、針刺組及針刺結合亞低溫組各15只。

1.4 干預方法

全部分組完成后各組大鼠行相應治療。正常組不做任何處理；假手術組、模型組捆綁30 min，每次12 h共72 h；亞低溫組捆綁30 min，每次12 h，參考舒鑫[13]亞低溫法并加以改良，將大鼠置于放有冰袋和碎冰的代謝籠中維持肛溫(33±1) ℃和鼓膜溫度(31±1) ℃于亞低溫狀態72 h，每1 h監測1次；針刺組捆綁并針刺“人中”“百會”“大椎”穴位[14]，捻轉法行針1 min并留針30 min(期間15 min時捻轉法行針1次，捻轉行針頻率90次/min)，每次12 h共治療72 h；針刺結合亞低溫組聯合使用針刺組和亞低溫組的處理方法。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 神經功能癥狀評分 參照Zea Longa五級四分法，所有大鼠分別于造模后、72 h后完成神經功能癥狀評分[12]。

1.5.2 梗死灶面積比測量 72 h后每組隨機取5只大鼠，麻醉后取全腦，冰凍固定，切片(約2 mm)后采用TTC 染色法，肉眼觀察梗死部位，數碼相機拍片，并用 BL-2000 圖像分析儀測定梗死面積比。

1.5.3 CIRI大鼠缺血側海馬組織miRNA功能檢測 72 h后每組隨機擇取5只大鼠，取患側(右)海馬用于抽提RNA，采用電泳法檢測RNA的完整性并篩選符合基因芯片試驗標準的RNA樣品。從符合要求的RNA樣品中對miRNA依次進行分離、標記及濃縮等處理并進行芯片雜交。使用GenePix 4000B Scanner掃描芯片，熒光波長為635 nm，應用Genepix Pro 6.0提取熒光強度數據并進行分析，篩選并獲得每2組間差異表達miRNA(顯著性水平為P<0.05)，最后通過GO數據庫查詢相關差異miRNA的功能。

1.5.4 miR-106b-5p表達量檢測 72 h后每組隨機取5只大鼠。分離患側(右)海馬用于RNA提取，進行miRNA反轉錄合成cDNA并運用SYBR法進行miR-106b-5p熒光定量PCR檢測，miR-106b-5p引物序列為：TAAAGTGCTGACAGT-GCAGAT。

1.6 統計學方法

本實驗設計方法為多樣本完全隨機設計，采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，實驗數據為計量資料，組內自身前后比較，符合正態分布者用配對t檢驗，不符合者采用配對秩和檢驗。符合正態分布方差齊者采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，不符合正態分布采用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺結合亞低溫對CIRI大鼠神經功能癥狀評分的影響

表1示，造模后組間比較，與正常組及假手術組比較，模型組、亞低溫組、針刺組及針刺結合亞低溫組神經功能癥狀評分顯著升高(P<0.01)，提示模型制備成功。組內與造模后比較，72 h后正常組、假手術組及模型組的神經功能癥狀評分差異無統計學意義(P>0.05)，而3個治療組(亞低溫組、針刺組及針刺結合亞低溫組)的神經功能癥狀評分均顯著下降(P<0.01)，因此認為3種治療方式均可改善CIRI大鼠神經功能癥狀。72 h后組間比較，與正常組及假手術組比較，模型組神經功能癥狀評分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，亞低溫組及針刺組神經功能癥狀評分明顯下降(P<0.05)，針刺結合亞低溫組的神經功能癥狀評分極其顯著下降(P<0.01)，提示針刺結合亞低溫法改善神經功能癥狀更具優勢。

表1 針刺結合亞低溫對CIRI大鼠神經功能癥狀評分的影響[M(Q)]

2.2 針刺結合亞低溫對CIRI大鼠腦組織梗死灶面積比的影響

圖1示，紅色區域為正常腦組織，白色區域為缺血腦組織，即圖中藍色箭頭所指。正常組及假手術組未見缺血組織，模型組可見大片缺血組織，亞低溫組及針刺組可見明顯缺血組織，而針刺結合亞低溫組僅見小片缺血組織。

圖1 各組大鼠梗死面積TTC染色圖

表2示，與正常組及假手術組比較，模型組梗死面積比顯著上升(P<0.01)，提示CIRI模型制備成功。與模型組比較，亞低溫組、針刺組及針刺結合亞低溫組梗死面積比顯著下降(P<0.05或P<0.01)，因此認為3種治療手段均能有效改善CIRI梗死面積。與亞低溫組比較，針刺組梗死面積比差異無統計學意義(P>0.05)，針刺結合亞低溫組梗死面積比明顯下降(P<0.05)，說明針刺結合亞低溫優于單用亞低溫的作用效果。

表2 針刺結合亞低溫對CIRI大鼠缺血側梗死面積比影響比較[M(Q)]

2.3 基因芯片檢測結果

2.3.1 CIRI大鼠缺血側海馬組織miRNA表達譜 圖2示，CIRI大鼠缺血側海馬組織差異miRNA聚類分析圖，橫列示差異miRNA，縱列示樣本組織，其中紅色熒光所示為高表達，綠色熒光所示為低表達。

圖2 CIRI大鼠缺血側海馬組織差異miRNA聚類分析圖

2.3.2 各組間差異miRNA功能情況 圖3示，與正常組比較，模型組差異表達4種miRNA，功能包括調節細胞增殖及細胞凋亡，提示造模后部分差異表達miRNA參與CIRI過程，其功能包括調節細胞增殖及細胞凋亡。與假手術組比較，模型組差異表達5種miRNA；與模型組比較，亞低溫組差異表達7種miRNA，針刺組差異表達16種miRNA及針刺結合亞低溫組差異表達23種miRNA，且差異miRNA功能均涉及調節細胞增殖、細胞凋亡、神經元分化、軸突延伸、基因表達及炎癥反應，可見治療后差異表達miRNA功能豐富。

圖3 各組間差異miRNA功能比較

2.4 CIRI大鼠缺血側海馬組織miR-106b-5p表達量

表3示，與正常組及假手術組比較，模型組大鼠腦缺血側海馬區miR-106b-5p表達量顯著上升(P<0.01)，提示miR-106b-5p上調參與CIRI過程。與模型組比較，3個治療組大鼠腦缺血側海馬區miR-106b-5p表達量均下降(P<0.05或P<0.01)，提示3種治療方式均下調CIRI后缺血側組織miR-106b-5p表達。與亞低溫組比較，針刺組大鼠腦缺血側海馬區miR-106b-5p表達量差異無統計學意義(P>0.05)，針刺結合亞低溫組大鼠腦缺血側海馬miR-106b-5p表達量明顯降低(P<0.05)，說明針刺結合亞低溫下調miR-106b-5p的表達較單一亞低溫處理更具優勢。

表3 各組miR-106b-5p相對表達量比較

3 討論

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要并發癥，屬于中醫學“卒中”“中風”[15]范疇。其病情是缺血性腦卒中恢復血供后繼發的腦組織損傷，較之原發病更為復雜[16]。迄今為止，抗腦缺血再灌注損傷治療多從抗炎、抗氨基酸毒性作用、抗鈣離子超載、抗一氧化氮累積及抗細胞凋亡等機制展開研究[17]，而從基因視角探討抗CIRI的治療鮮有報道。針刺是中醫臨床治療腦病的常用手段，可以較好地改善患者運動障礙等后遺癥，同時有臨床研究發現，亞低溫法可有效降低大面積急性腦梗死神經功能缺損評分，提升臨床治療效果[18，19]。諸多實驗研究證實，單純針刺或亞低溫療法均對CIRI后miRNA的表達有著重要的調控作用[20，21]。故本研究將中醫針刺與亞低溫結合作為干預手段，從基因水平探討針刺結合亞低溫抗腦缺血再灌注損傷作用。根據本實驗結果可知，與模型組比較，治療組的神經功能癥狀評分及腦梗死面積比均下降，說明無論是單獨針刺或亞低溫，亦或是聯合針刺與亞低溫的治療方法均能有效改善CIRI神經功能癥狀及腦梗死面積。

miRNA家族種類繁多，功能豐富，可參與調節細胞凋亡、細胞增殖、炎癥反應等功能活動，與疾病的演變密切相關[22，23]。如miRNA可通過參與腦缺血再灌注過程的神經發生、炎癥反應、腦水腫、細胞凋亡及氧化應激等影響CIRI演變[24]。本實驗結果顯示，造模后4種miRNA發生差異表達，其功能僅調節細胞增殖及細胞凋亡。而應用亞低溫、針刺及針刺結合亞低溫治療后，與模型組比較，各治療組差異miRNA不僅種類大幅增加，而且功能也更為豐富，除可調節細胞增殖及細胞凋亡外，還可調節神經元分化、軸突延伸、基因表達及炎癥反應，由此可見CIRI損傷的修復與差異miRNA功能的豐富相關。而與其他2種治療方法比較，針刺結合亞低溫組各功能的差異miRNA數量占據明顯優勢，可見針刺結合亞低溫抗CIRI的效果與激發差異miRNA功能密切相關。

miR-106b-5p是miRNA家族成員之一，與諸多疾病的診斷、治療及預后有關[10，11]。李鵬飛等[25]認為，血清中miR-106b-5p對提高診斷缺血性腦卒中的準確性具有重要意義。本實驗在造模后發現，miR-106b-5p表達上調，與上述觀點一致，可見miR-106b-5p的表達水平關乎CIRI的發生。而運用亞低溫、針刺及針刺結合亞低溫法干預后可下調miR-106b-5p表達，說明這幾種治療手段均可通過下調miR-106b-5p，改善CIRI實現腦保護，且下調miR-106b-5p表達量或決定了CIRI改善程度。

針刺治療腦血管疾病的療效值得肯定[26]，但事實上單純針刺法治療腦卒中在臨床并不常見，多聯合使用其他手段進行治療，如針電結合、針藥結合及針刺聯合康復訓練等方法，在獲得不錯的臨床效果的同時，也普遍被患者及患者家屬所接受[27-29]。而諸多研究同樣證實，亞低溫可從多方面達到抗CIRI的目的[30]。本實驗運用針刺結合亞低溫法治療CIRI大鼠，結果發現針刺結合亞低溫法對改善CIRI神經功能癥狀及腦梗死面積較單純針刺或亞低溫法更具優勢。

綜上所述，針刺結合亞低溫法可有效改善CIRI，且其機制或與miRNA功能及下調miR-106b-5p表達量進而實現腦保護有關，值得臨床推廣應用。