背俞指針療法對GERD大鼠胃起搏區MLCK及PMLC20表達水平的影響?

黃美禎， 譚金晶， 宋慶增， 劉禮劍， 韋金秀， 周曉玲， 黎麗群， 岑前麗， 李建鋒， 謝 勝△

(1.廣西中醫藥大學， 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院， 南寧 530023；3.柳州市中醫院，廣西 柳州 545001)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃或十二指腸內容物反流入食管，從而引起反酸、燒心等與反流相關癥狀或并發癥的疾病[1]。GERD為多發性疾病，其全球總體發病率為13%并呈上升趨勢[2]。研究發現，GERD具有病程長、復發率高等特點，可增加肺癌、食管癌、冠心病等多種疾病的發病風險，嚴重影響患者的身心健康和生活質量[3]。因此，積極防治GERD對公共衛生事業具有重大意義。本團隊前期研究發現，背俞指針療法治療GERD療效確切，可顯著改善食管下括約肌壓力及胃電節律，明顯減少酸反流[4-6]。然而，該療法治療GERD作用的分子機制尚未完全明確。

食管、胃動力障礙是GERD的主要發病機制之一，而胃動力障礙與平滑肌結構、功能異常密切相關[7-9]。研究表明，胃平滑肌細胞內肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)通過使肌球蛋白調節性輕鏈(20kD Myosin light chain phosphorylation, MLC20)磷酸化，形成磷酸化肌球蛋白調節性輕鏈(phosphorylation 20kD Myosin light chain phosphorylation, PMLC20)，從而活化肌球蛋白ATP酶，引起平滑肌的收縮，故MLCK- PMLC20信號通路在調控平滑肌細胞運動功能中起重要作用[10，11]。因此，本研究以GERD大鼠為研究對象，探討MLCK-PMLC20信號通路異常是否為GERD的發病機制，并觀察背俞指針療法對該信號通路的影響，明確該療法治療GERD的分子作用機制。本研究已通過廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理學批準號DW20180101-25。

1 材料與方法

1.1 動物

適齡清潔級SD大鼠124只，雌雄各半，體質量220～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(湘)2016-0002。飼養于廣西中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%。

1.2 主要試劑及儀器

熒光定量PCR試劑盒(貨號RR047A、RR820A)TaKaRa公司；MLCK(貨號bs-4705R)及PMLC2(貨號bs-19149R)抗體，北京博奧森公司；IgG免疫組化試劑盒(貨號SABC-POD)，武漢博士德公司。

展烤片機TY-7FB(天津愛華)；超速低溫離心機1730R(美國 Sigma 公司)；光學顯微鏡Olympus-BH2(日本Olympus公司)；顯微攝像儀 Olympus-C35AD-2(日本 Olympus 公司)；病理切片機 LEICA RM2135(德國RM公司)；分光光度計 722 型(四川儀表九廠)；7000型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；紫外透射儀 ZF-90 (上海顧村電光儀器廠)；紫外分光光度計 752型(上海精密科學儀器有限公司)；圖像分析系統Image-Pro Express(日本 Olympus 公司)。

1.3 造模及分組方法

將購回的124只SD大鼠進行標記，采用隨機數字表法隨機抽取30只作為空白組(開腹后不手術即縫合，無反流對照組)，其余94只SD大鼠建立GERD模型。大鼠購回后適應環境7 d，手術前禁食24 h。采用經食管支架植入術造模[12]：大鼠麻醉后備皮，碘伏消毒術區后開腹，將鋼圈 (直徑0.31 mm, 內徑3.5 mm, 長5～6 mm) 套在鞘芯上, 從口腔經食管送于賁門處, 先退出鞘芯再退出鞘, 用魚線 (0.4號, 0.10 mm)將鋼圈固定于賁門處, 腹腔內注入青霉素后關腹。空白組進入腹腔前的操作同模型組，開腹后使用0.9% NaCl溶液灌洗腹腔，縫合線逐層關腹。所有大鼠術后禁食24 h不禁水，4周后隨機抽取4只大鼠的食管標本進行病理檢測，明確造模成功后根據隨機數字表法隨機分為模型組、指針組及西藥組各30只。

1.4 干預方法

1.4.1 西藥組 西藥組參考《動物與人體的每公斤體質量劑量折算系數表》[13]計算出每只大鼠干預所需劑量。給予枸櫞酸莫沙必利分散片(成都康弘藥業集團股份有限公司，批號H20031110，1.56 mg/kg)每日均分灌胃3次，每次1 mL；蘭索拉唑腸溶片(汕頭經濟特區鮀濱制藥廠，批號H10980136，3.125 mg/kg)每日均分灌胃2次。空白組和模型組給予等量純水灌胃，各組均干預14 d。

1.4.2 背俞指針組 參照文獻選取大鼠雙側足太陽膀胱經肝俞、膽俞、脾俞、胃俞穴，于每天上午9～11點進行干預[14]。先將大鼠固定于俯臥位，左手罩住頭部，右手輕撫背部4 min。指針操作如下：不同穴位從上到下、相同穴位由左至右，對每個穴位進行相應點壓、按揉等手法操作，刺激量以大鼠無掙扎為度，頻率為120～160次/min，時間為3 min/穴，每只大鼠每天手法操作24 min，療程為2周。干預前對相關人員進行2周培訓，在電子天平儀上練習，力求達到按揉質量200～250 g、點壓質量300～350 g的標準。

1.5 標本采集

實驗周期結束大鼠禁食不禁水12 h后，采用放血法將麻醉(25%烏拉坦6 mL/kg腹腔注射)后大鼠處死，隨后進行食管組織及胃組織標本取材，于食道賁門上緣處取出食管組織約3 cm，于大鼠胃竇處(距幽門約0.5 cm)取10×10×5 mm3的平滑肌條，切取實驗所需的胃起搏區組織-80 ℃保存。

1.6 檢測指標

1.6.1 各組大鼠一般情況 觀察各組大鼠的精神狀態、反應、毛色、糞便、飲食、飲水量等，觀察各組大鼠存活率和手術造模傷口愈合情況。

1.6.2 光鏡下觀察食管中下段組織病理變化 各組均隨機抽取8只大鼠作為觀察樣本，將取出的食管組織經HE染色后在光鏡下觀察組織的鱗狀上皮、上皮細胞層、黏膜固有層的病理變化，并進行對比分析。

1.6.3 熒光定量PCR法檢測胃起搏區組織MLCK mRNA的表達情況 取出胃起搏區平滑肌組織，切取實驗所需量(30～50 mg)，采用Trizol法提取總RNA，紫外-分光光度計測定所提取RNA濃度及含量，采用TaKaRa公司試劑盒行常規逆轉錄聚合酶鏈反應，逆轉錄所用的引物根據GenBank登錄的MLCK核苷酸序列設計引物，委托寶生物工程(大連)技術服務有限公司進行合成，上游引物5’-GTGGTGGTAGCGGAGAGAAG-3’，下游引物5’-CCTTGTGGCCAGTTCATCCT-3’，引物長度為144bp。反應條件：預變性(94 ℃，5 min)；變性(95 ℃，30 s)；退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，30 s)，共進行40個循環的擴增，以上反應流程均參照TaKaRa公司試劑盒說明書進行。反應完成后采用SYBRGreenⅠ法進行擴增產物定量檢測，擴增反應于ABI 7000熒光定量PCR儀上進行，并采用2-ΔΔCT法比較各組MLCK mRNA表達水平的差異。

1.6.4 免疫組化法觀察胃起搏區組織MLCK及PMLC20的表達 切取大鼠胃起搏區(胃體中部距賁門1/3處)組織約1.0 cm3，石蠟切片4 μm，烤片后脫蠟至水，高壓抗原修復，依次滴加3%過氧化物酶阻斷液(室溫10 min)、5% BSA封閉液(室溫30 min)、一抗(1∶300,4 ℃過夜)，二抗(37 ℃孵育30 min)及SABC(37 ℃孵育30 min)，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作陽性MLCK及PMLC20對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片隨機選取5個視野，采用image-Pro圖像分析系統，測定并計算出平均光密度值(mean optical density, MOD)，用于各組MLCK及PMLC20表達水平的比較。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

空白組大鼠反應敏捷，毛色光澤，糞便正常；模型組大鼠反應較遲鈍，毛色無光澤，糞質干硬，每日飲食、飲水量稍減少，可見少量反流物；指針組及西藥組大鼠反應較模型組敏捷，毛色較光澤，指針組大便正常，西藥組大便偏爛。各組大鼠均無死亡，造模組大鼠傷口愈合良好。

2.2 GERD大鼠干預后食管中下段組織病理變化

圖1示，各組食管黏膜組織病理變化，空白組食管黏膜組織形態正常，未見黏膜糜爛及潰瘍，黏膜上皮未見增生，固有層未見炎性細胞浸潤；模型組食管鱗狀上皮基底細胞中度增生，基底細胞層增厚，固有層乳頭延長，固有層內炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，細胞間隙增寬；指針組食管黏膜結構基本恢復正常，鱗狀上皮修復完整，基底細胞呈單層排列，黏膜固有層未見明顯的乳頭增生及炎性細胞浸潤；西藥組食管黏膜結構基本恢復正常，黏膜固有層未見明顯的炎性細胞浸潤。

圖1 各組大鼠食管黏膜中下段組織鱗狀上皮、黏膜固有層、上皮細胞層病理變化比較(HE×200)

2.3 GERD大鼠干預后胃起搏區組織MLCK及PMLC20表達結果

剔除異常數據后，空白組、模型組、西藥組、模型組分別納入11、12、11、14個樣本分析MLCK mRNA表達水平。表1示，與空白組比較，模型組大鼠MLCK mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；西藥組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；指針組較模型組及西藥組明顯升高(P<0.05)。

圖2、3示，MLCK及PMLC20陽性表達細胞分布于胃起搏區組織內環外縱肌層間，呈棕黃色染色。表1示，與空白組比較，模型組MLCK及PMLC20的表達水平有所下降(P<0.05)；與模型組比較，西藥組及指針組MLCK及PMLC20的表達水平有顯著上升(P<0.01)；與西藥組比較，指針組的MLCK表達水平降低(P<0.05)，而西藥組和指針組PMLC20表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 MLCK mRNA、MLCK陽性產物及PMLC20陽性產物表達比較

圖2 各組大鼠胃起搏區組織肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin Light Chain Kinase，MLCK)免疫組化陽性表達(200×)

圖3 各組大鼠胃起搏區組織磷酸化肌球蛋白調節性輕鏈(Phosphorylation 20kD Myosin light chain phosphorylation，PMLC20)免疫組化陽性表達(200×)

3 討論

目前國內大部分學者認為，GERD的基本病機為脾胃升降功能失常，胃氣上逆[15]。本團隊多年來致力于GERD的實踐與研究，認識到“脾胃氣機失衡是GERD發病的表象，而任督二脈經氣升降交會失衡是脾胃升降失衡GERD的病機本質”[16，17]。督脈為陽脈之海，與膀胱經交會于大椎等穴位及巔頂部，故膀胱經之經氣可通諸陽之會，調達一身之陽氣。背俞穴是五臟六腑之精氣輸注于膀胱經上的穴位。本團隊前期研究發現，在背俞穴處施予背俞指針療法可調節任督二脈經氣的交會，改善多個臟腑的功能，從而達到治療GERD的目的[4-6]。基于此，筆者團隊提出“以俞調樞”的觀點，構建了“以俞調樞”理論體系[16，17]。同時前期臨床研究表明，背俞指針療法可以促進胃腸收縮及蠕動，降低食管括約肌壓力和減少酸反流，治療GERD效果確切[4-6]。本次研究的病理結果顯示，與模型組比較，指針組食管黏膜結構基本恢復正常，食管組織炎癥消失，提示背俞指針療法可以改善GERD模型大鼠的食管黏膜病理改變，促進炎癥消退。這可能與此療法能調節任督二脈穴位的皮溫，調節二脈經氣的交會，進而改善脾胃之氣機升降功能有關[18]。

MLCK是一種廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶[19]。MLCK使肌球蛋白調節性輕鏈磷酸化并控制骨骼肌、平滑肌和心肌的收縮[20]。胃排空障礙與胃平滑肌收縮密切相關。在調節平滑肌收縮機制中, MLCK可使 MLC20磷酸化，磷酸化后的MLC20為PMLC20，可以使肌球蛋白ATP酶活化，觸發肌動蛋白-肌球蛋白交叉橋接機制，引起平滑肌的收縮。在平滑肌的MLCK-PMLC20通路中，MLC20磷酸化水平在一定程度上決定著平滑肌收縮的功能。MLC20磷酸化的程度取決于MLCK活性，而MLCK mRNA是合成MLCK的模板[20]。本研究發現，模型組大鼠在胃起搏區的MLCK mRNA、MLCK及PMLC20蛋白表達水平均低于空白組大鼠，說明GERD大鼠胃動力障礙可能與MLCK及PMLC20表達量降低有關，且與其他胃動力障礙性疾病大鼠模型的胃平滑肌MLCK和PMLC20表達水平變化相一致[21-23]。

本次研究中，干預后指針組中MLCK mRNA水平較模型組升高，且MLCK及PMLC20陽性蛋白表達均高于模型組，說明背俞指針療法能上調GERD大鼠胃起搏區MLCK mRNA、MLCK及PMLC20陽性蛋白表達，從而達到治療GERD的目的。于上午脾經當令之巳時(9～11點)進行背俞指針療法，可激發膀胱經經氣, 從而使任督二脈經氣升降交會，以恢復脾胃之氣機升降，調暢五臟六腑臟腑樞機，恢復MLCK-PMLC20通路的“樞機”。結合病理結果說明，背俞指針療法治療GERD可能是通過上調胃起搏區MLCK mRNA、MLCK及PMLC20這一機制起作用。然而，西藥組的MLCK mRNA表達與模型組比較差異無統計學意義，其蛋白表達水平卻高于模型組，說明2組雖然以同等水平mRNA為模板合成的MLCK沒有增加，但是用藥后可能使合成MLCK的其他相關因子增加，或者使蛋白相較模型組分解減少，從而提高西藥組MLCK的表達，具體機制尚未明確。西藥組的MLCK蛋白表達水平高于指針組，但是最后2組間的PMLC20蛋白表達水平無明顯差異，可能與指針組還能通過其他途徑增加MLC20磷酸化有關，值得進一步探討。

綜上所述，GERD的發病可能與MLCK mRNA、MLCK、PMLC20蛋白表達水平下降有關。背俞指針療法可明顯改善GERD大鼠食管病理改變，其機制可能與上調MLCK mRNA、MLCK、PMLC20蛋白表達水平有關。然而目前尚有許多問題,如背俞指針療法是如何上調MLCK mRNA及其蛋白表達,其是否會通過除MLCK的其他通路影響MLC20磷酸化，均有待今后進一步的研究。