響應曲面法優化敗毒散提取工藝△

徐坤勇，郭建忠，顏娟，韻國萍*

1.張家口市第一醫院 藥學部，河北 張家口 075000；

2.河北北方學院 附屬第一醫院 藥學部，河北 張家口 075000

敗毒散最早源于宋代《太平惠民和劑局方》，現收錄于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版，為成方制劑，由枳殼（100 g）、黨參（100 g）、茯苓（100 g）、甘草（50 g）、川芎（100 g）、羌活（100 g）、獨活（100 g）、柴胡（100 g）、前胡（100 g）及桔梗（100 g）組成。傳統醫學認為，敗毒散有發汗解表、散風祛濕的功能，臨床主要用于外感熱病、憎寒壯熱、項強頭痛、四肢酸痛、噤口痢疾、無汗鼻塞、咳嗽有痰[1]。敗毒散在現代臨床中主要用于治療急性頜下淋巴結炎、呼吸系統疾病、流行性腮腺炎、急性病毒性肝炎等[2]。枳殼的主要成分為柚皮苷和新橙皮苷，具有誘導甲狀腺癌細胞凋亡、抗基因突變、抗菌、抗炎、抗過敏、抗微生物、抗腫瘤、保護受損心肌等藥理作用[3-6]，故柚皮苷和新橙皮苷常作為評價枳殼藥材質量的重要指標[7-9]。

敗毒散方原用法為燉湯內服，存在煎煮、服用和攜帶不方便等問題。其顆粒劑具有服用和攜帶方便、載藥量大、穩定性好等優點，可以滿足患者長期服用和臨床用藥需要[10]。響應曲面法能直觀反映各影響因素之間的交互關系，快速得到最佳工藝時各因素的水平[11]。經文獻檢索發現，目前國內外關于敗毒散提取工藝的報道不多。因此，本研究在單因素試驗的基礎上，以收膏率和柚皮苷、新橙皮苷含量的綜合評分為考察指標，采用響應曲面法優選敗毒散提取工藝，擬將其制備成顆粒劑，為敗毒散制劑后續研究開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；FW-400A 型傾斜式萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）；GZX-9140MBE 型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）；HH-2 型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇榮華儀器有限公司）；AE/240 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試藥

枳殼、黨參、茯苓、甘草、川芎、羌活、獨活、柴胡、前胡及桔梗10 味中藥均購自張家口市張垣中藥飲片有限公司（批號分別為20190901、20191002、20200203、20200301、20191201、20190701、20190602、20200401、20181101、20190301），經中國中醫科學院中藥資源中心楊光副研究員鑒定均為正品。

對照品柚皮苷（重慶對照品科技有限公司，批號：110722-201312，純度≥98%）；對照品新橙皮苷（西安旭煌技術有限公司，批號：N-19020，純度≥97%）；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 新橙皮苷、柚皮苷含量測定

2.1.1 色譜條件 參考《中國藥典》2020 年版[1]，色譜柱為Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸水溶液（20∶80）為流動相，流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為283 nm；柱溫為室溫；進樣量為5 μL；理論板數按柚皮苷峰計算應不低于3000。見圖1。

圖1 敗毒散中柚皮苷及新橙皮苷HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定新橙皮苷對照品80.03 mg、柚皮苷對照品80.00 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，超聲使溶解，搖勻，作為對照品儲備液。使用時，精密量取上述溶液5 mL，置于25 mL 量瓶中，適量甲醇稀釋，制成新橙皮苷和柚皮苷質量濃度均為160 μg·mL-1的溶液，冰箱冷藏備用。

2.1.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備 按敗毒散處方比例分別稱取各飲片，總量為95 g，粉碎成粗粉，過篩，混勻。取上述粗粉約20 g，精密稱定，按各因素條件提取，放冷后濾過，使用蒸發皿蒸干，加適量甲醇溶解，并用甲醇洗滌干凈，溶液及洗滌液轉移至1000 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，超聲，搖勻，作為供試品儲備液。使用時，移取上述儲備液10 mL，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取中間續濾液5 mL，即得。同法制備不含敗毒散的溶液即為陰性樣品溶液。

2.1.4 線性關系考察 分別精密量取2.1.2項下新橙皮苷、柚皮苷混合對照品儲備液適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為8、32、64、120、160、240 μg·mL-1的對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進行色譜分析，記錄峰面積。分別以峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，作標準曲線。新橙皮苷標準方程為Y=5.49×103X+4.36×104，r=0.999 4，質量濃度為8～240 μg·mL-1線性關系良好；柚皮苷標準方程為Y=4.93×103X+3.77×104，r=0.999 7，質量濃度為8～240 μg·mL-1線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密量取2.1.2 項下新橙皮苷、柚皮苷混合對照品溶液5 μL，按照2.1.1 項下色譜條件連續進樣6 次，分別測定新橙皮苷、柚皮苷峰面積，新橙皮苷峰面積RSD 為0.97%，柚皮苷峰面積RSD為0.82%。說明該方法精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批敗毒散（批號：20200402）粗粉6份，按2.1.3項下方法平行制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件分別進樣測定。結果新橙皮苷平均質量分數為4.13 mg·g-1（每克敗毒散含枳殼以新橙皮苷計，下同），RSD 為1.56%，柚皮苷的平均質量分數為7.08 mg·g-1（每克敗毒散含枳殼以柚皮苷計，下同），RSD為1.42%，表明該方法的重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 分別精密量取2.1.3 項下同一供試品溶液5 μL，分別于0、1、3、6、12、18、24 h按2.1.1 項下色譜條件進行測定，結果新橙皮苷峰面積RSD 為1.84%、柚皮苷峰面積RSD 為1.27%。說明在制備后24 h內供試品溶液質量穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已測含量的敗毒散（含新橙皮苷約為4.15 mg·g-1、含柚皮苷約為7.06 mg·g-1）粗粉6 份，精密稱定，每份約2 g。分別加入新橙皮苷對照品約8.30 mg，柚皮苷對照品約14.12 mg，按2.1.3項下方法制得供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定（表1）。新橙皮苷平均回收率為98.90%，RSD 為1.97%；柚皮苷的平均回收率為97.74%，RSD為1.76%，說明該方法的準確度良好。

表1 敗毒散中柚皮苷及新橙皮苷含量測定的加樣回收率試驗

2.2 收膏率測定

精密量取2.1.3 項下供試品儲備液200 mL，轉移至已干燥質量恒定的蒸發皿中，水浴蒸干，烘箱105 ℃干燥3 h，干燥器中冷卻，待降至常溫，立即稱質量。收膏率按公式（1）計算。

2.3 提取工藝單因素考察

2.3.1 提取工藝評價指標的建立 在實際生產中，收膏率常作為控制指標之一，確定為次要指標，賦予20%的權重；主要指標確定為柚皮苷、新橙皮苷含量，各賦予40%的權重。按公式（2）計算綜合得分（Y）[12]。

式中，R為收膏率，Rmax為收膏率最大值；Cn為柚皮苷含量，Cnmax為柚皮苷含量最大值；C為新橙皮苷含量，Cmax為新橙皮苷含量最大值。

2.3.2 提取方法考察

2.3.2.1 超聲提取法 取敗毒散粗（批號：20200402）粉約20 g，精密稱定，加無水乙醇200 mL 超聲（400 W，40 kHz）提取2 次，每次2 h，提取液按2.1.3 項下供試品溶液制備方法處理。測定收膏率和柚皮苷、新橙皮苷含量，并計算綜合得分，試驗平行3次。結果見表2。

2.3.2.2 乙醇回流提取法 取敗毒散（批號：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，加無水乙醇200 mL回流提取提取2次，每次2 h，其余同超聲提取法。見表2。

表2 敗毒散提取方法考察

2.3.2.3 水煎煮法 取敗毒散（批號：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，200 mL 水煎煮提取2 次，每次2 h，其余同超聲提取法。見表2。

結果表明，水煎煮法收膏率最高；柚皮苷、新橙皮苷含量及綜合得分略低于回流提取法和超聲提取法，但相差不大，從經濟因素考慮，確定提取方法為水煎煮法。

2.3.3 液料比的考察 取敗毒散（批號：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，水煎煮法提取2次，每次2 h，考察不同液料比時綜合得分，平行3份。見表3。綜合得分隨液料比增加而增大，而后減小，綜合得分最高時，液料比為12∶1，故液料比中心點確定為12∶1。

表3 敗毒散不同液料比對各評價指標及綜合得分的影響

2.3.4 提取時間的考察 取敗毒散（批號：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，200 mL 水煎煮提取2次，考察不同提取時間時綜合得分，平行3份。見表4。綜合得分隨提取時間增加而增大，而后減小，綜合得分最高時，提取時間為3 h，故提取時間中心點確定為3 h。

表4 敗毒散不同提取時間對各評價指標及綜合得分的影響

2.3.5 提取數的考察 取敗毒散（批號：20200402）粗粉約20 g，精密稱定，200 mL 水煎煮提取2 h，考察不同提取數時綜合得分，平行3 份。見表5。綜合得分最高時，提取數為4次，提取數為3次時略低于4次，考慮生產成本和提取效率，故提取數確定為3次。

表5 敗毒散不同提取數對各評價指標及綜合得分的影響

2.4 Box-Behnken響應面法優化敗毒散提取工藝

2.4.1 響應面設計及試驗結果 通過Design-Expert 8.0.6軟件建立響應面分析模型。通過單因素考察確定3 個影響因素，分別為液料比（A）、提取時間（B）及提取數（C）。因素水平見表6。響應值為敗毒散提取評價綜合得分，建立Box-Behnken 分析模型，進行提取工藝優選，響應面設計及試驗結果見表7。

表6 敗毒散提取工藝響應面試驗因素水平

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗 將表7 試驗條件及結果導入Design Expert 8.0.6 軟件進行回歸分析。Y對A、B、C 的多項二次回歸模型為Y=86.21+15.41A+2.82B -2.34C -4.06AB -5.28AC+0.50BC-21.25A2-3.04B2-5.93C2，通過方差分析考察其顯著性。結果見表8。由表8可知，失擬項P=0.101 8＞0.05，模型P<0.000 1，r=0.991 4，表明未知因素干擾小，失擬項不顯著，回歸模型具極顯著性，擬合程度好，該模型可用于敗毒散提取工藝條件的分析和預測。由方差分析可知，一次項B、C 因素對綜合得分影響顯著，A 因素影響具極顯著性；交互項BC 因素對綜合得分影響不顯著，AB 因素影響具顯著性，AC因素影響具極顯著性；二次項B2因素對綜合得分影響顯著，A2、C2因素影響具極顯著性。由方差分析單因素F值可看出，C 因素對綜合得分影響最小，B 因素次之，A 因素最大。綜上所述，各因素的影響順序為C

表7 敗毒散提取工藝響應面試驗設計及結果

表8 敗毒散提取工藝響應面方差分析結果

2.4.3 響應面分析 二維平面圖等高線形狀和三維曲面圖坡度可反映各因素交互作用水平，當等高線呈橢圓形且密集時，表明交互作用強，當三維曲面圖陡峭，坡度大時，說明影響差異有統計學意義[13]。通過Design Expert 8.0.6 軟件分析得到反映三因素交互作用水平的二維平面等高線圖和三維曲面圖。見圖2～4。圖2～3中二維平面圖等高線呈橢圓形且密集，三維響應曲面坡度大，說明A因素和B、C因素交互作用強，圖4 中二維平面圖等高線雖近似橢圓形但不密集，且三維響應曲面坡度小，說明B、C因素交互作用弱，與方差分析結果相符。

圖2 液料比與提取時間對敗毒散提取工藝影響的等高線圖和響應曲面圖

圖3 液料比與提取數對敗毒散提取工藝影響的等高線圖和響應曲面圖

圖4 提取時間與提取數對敗毒散提取工藝影響的等高線圖和響應曲面圖

2.4.4 驗證實驗 以Design Expert 8.0.6 軟件分析敗毒散提取工藝，當液料比為13.81∶1，提取時間為2.84 h，提取數為2.32 次時，綜合得分最大，預測值為89.13%。考慮生產實際，將敗毒散提取工藝參數調整為液料比14∶1，提取時間170 min，提取2 次。按敗毒散處方比例分別稱取各飲片，總量為950 g，平行3 次，以驗證工藝的可靠性和模型的合理性。結果RSD 為0.55%，表明工藝可靠且模型合理。

3 討論

創制中藥新劑型過程中，提取工藝對中藥提取效果有直接影響，進而影響療效。傳統復方中藥組分復雜，為充分提取藥效組分，故選用多指標對敗毒散提取工藝進行評價。收膏率可反映其他組分的提取程度，為考察中藥提取效果的重要指標[14]；新橙皮苷和柚皮苷為枳殼含量較高的主要活性物質，也是《中國藥典》2020 年版枳殼藥材考察含量的指標，且在《中國藥典》2020 年版敗毒散質量標準含量測定項，以枳殼中柚皮苷含量作為唯一控制指標，因此，在許多含有枳殼的中藥制劑中，大多采用柚皮苷和新橙皮苷作為考察指標。本研究以收膏率和新橙皮苷、柚皮苷含量為綜合考察指標優化敗毒散提取工藝。

對中藥提取因素多參數進行優化時，各影響因素與響應值之間往往線性關系不佳。通過考察各影響因素之間的交互作用，擬合最佳提取工藝，建立非線性回歸模型的響應曲面法，是一種精度高、預測性好且應用范圍大的統計方法，近幾年廣泛應用于中藥活性成分提取工藝的優化[15-17]。響應曲面法中擬合結果和單因素的取值范圍關系密切，本研究通過考察單因素影響試驗，先確定敗毒散提取方法為水煎煮法，后確定各因素的中心點和取值范圍。其中液料比的中心點為12∶1，提取時間的中心點為3 h，提取數的中心點為3 次。在此基礎上，通過Design Expert 8.0.6軟件分析，得到擬合度好、極顯著的多項二次回歸模型。方差和響應面分析結果表明，優選工藝方法可靠、準確性好。敗毒散最佳提取工藝條件為液料比14∶1，提取時間170 min，提取2 次，在該條件下，綜合得分為87.67%，與預測值接近。驗證實驗結果表明，優選工藝重復性好、條件可靠。