利用TRV過表達和沉默系統驗證植物油脂合成相關基因的功能

江 悅， 謝桂蘭， 陳 放， 徐 鶯

(四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610064)

1 引 言

煙草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus, TRV)是一種雙正鏈RNA病毒，其基因組由RNA1和RNA2兩部分組成.RNA1的大小和基因序列比較保守，主要包括依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和移動蛋白(Movement Protein, MP)，其可以使病毒粒子在宿主植物內復制和移動. RNA2一般包含病毒衣殼蛋白(Coat Protein, CP)和一些非結構性基因，RNA2基因組可以被修飾以攜帶外源基因，因此目的基因通常被克隆到RNA2上[1]. 煙草脆裂病毒不僅能夠侵染煙草，還能夠侵染番茄果實、辣椒葉、矮牽?；?、耬斗菜、唐松草花、玫瑰花、草莓果實、加州罌粟、麻瘋樹、紫茉莉[2]和菠菜[3].

在植物油脂基因工程中，常用傳統的轉基因技術，即將特定外源基因穩定的在受體生物中表達[4]，但實驗過程繁瑣，周期較長，而利用煙草農桿菌介導的瞬時系統僅在被侵染葉片表達目的基因[5]. TRV作為一種植物病毒載體，具有復制快，感染強，對植株傷害小等優點，不僅能在侵染葉片表達目的基因，在未侵染葉片也能檢測出目的基因的表達[6].

研究發現WRI1是提高總油脂含量的關鍵基因[7]，而FAD2基因是單不飽和脂肪酸生成多不飽和脂肪酸的關鍵[8].而多不飽和酸不利于儲存，沉默FAD2基因可以減少多不飽和脂肪酸的含量[9]. 本研究通過構建TRV-WRI1過表達載體和TRV-FDA2沉默載體，對侵染7天和14天的本氏煙草株系WRI1下游基因進行定量分析，并測定植株葉片的脂肪酸含量和種類，探討利用TRV過表達系統進行油脂相關基因功能研究的可行性.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 植物材料 本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子為本實驗室保存.

2.1.2 菌株和質粒 大腸桿菌(E.coli)和農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株于-80 ℃冰箱保存. 煙草脆裂病毒過表達及沉默載體菌株于-80 ℃冰箱保存.

2.1.3 PCR引物 見表1.

表1 本文中所用PCR引物

2.2 方 法

2.2.1WRI1和FAD2基因序列克隆和載體構建 以擬南芥RNA經反轉錄的cDNA為模板，利用高保真酶Primer STAR Max(TaKaRa, Japan)進行WRI1和FAD2基因的擴增，引物序列如表1所示. 利用TaKaRa公司的限制性核酸內切酶對TRV載體的TRV2質粒和PCR產物進行雙酶切. 酶切反應結束后用核酸純化回收試劑盒回收酶切產物，然后進行連接. 測序后轉入農桿菌GV3101.

2.2.2 農桿菌重懸液制備 將轉入TRV-WRI1和TRV-FAD2的農桿菌接種到含有Kana、Rif抗性的培養基中，28 ℃，200 r/min活化24 h；取1 mL活化菌液加入 YEB培養基，28 ℃，200 r/min，12 h，直至OD600≈0.8～1.0；5 000 r/min，常溫離心富集農桿菌菌體；用重懸液(1 mol/L MgCl2，1 mol/L MES，200 mmol/L AS)重懸菌體至OD6000.8～1.0，將TRV2菌液與TRV1菌液按照1∶1體積混勻，室溫避光靜置2～4 h.

2.2.3 侵染本氏煙草 選擇4～6葉期的本氏煙草，將農桿菌重懸液注射擴散到膨大葉的遠軸側. 每株植物注射2～3片葉，將侵染后暗室培養24 h后，置于25 ℃，16 h/8 h光周期溫室培養.

2.2.4 qRT-PCR分析 利用天根生物RNAPrep Pure Plant Kit試劑盒提取本氏煙草總RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa, Japan)試劑盒合成單鏈cDNA. 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑對WRI1下游基因進行qRT-PCR擴增，所用引物見表1.

2.2.5 油脂成分測定 稱取0.1 g侵染后的本氏煙草葉片或侵染后的系統葉葉片放入玻璃管中，加入1 mL新鮮配制的5%硫酸甲醇溶液(v/v). 加入300 μL甲苯作為促溶劑，再加入10 μL 2%的BHT溶液和10 μg十七烷酸甘油三酯溶液作為內參；各試劑加入結束后迅速震蕩混勻，90～95 ℃水浴反應1.5～2 h；取出玻璃管冷卻至室溫，加入1.5 mL新鮮配制的0.9% NaCl溶液，混勻. 再向玻璃管中加入1 mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，震蕩混勻，靜置5 min，取上清液于2 mL棕色玻璃瓶中；用氣相色譜與質譜聯用儀GC-MS 2010對提取的脂肪酸甲酯含量進行測量，分離柱為HP-88. GC條件為：火焰離子化檢測器和加樣器溫度為220 ℃. 爐溫升溫程序為：160 ℃，保持1 min；然后每分鐘升高10 ℃，升到200 ℃，保持1 min；然后每分鐘升溫5 ℃，升到210 ℃，保持1 min. 脂肪酸甲酯含量通過與內參的峰面積對比進行計算.

3 結果與分析

3.1 TRV-WRI1過表達載體及TRV-FAD2沉默載體構建

用表1中設計的引物進行擴增，凝膠電泳檢測出WRI1大小約1 300 bp，FAD2大小約為500 bp(圖1)，片段大小與預期結果相符.

圖1 WRI1和FAD2基因PCR產物電泳圖

3.2 TRV-WRI1過表達植株中下游基因表達量分析

用TRV-WRI1過表達載體的農桿菌侵染本氏煙草植株后，分別在侵染后第6 d和第13 d提取系統葉葉片的總RNA，以煙草β-actin為內參，利用qRT-PCR技術檢測WRI1轉錄因子相關基因的表達量. 本研究對ACP1，KAS1，BCCP2，Pkb1和SUS2基因進行定量分析，實驗結果表明，無論是在侵染葉還是系統葉中，過表達株系的這5個相關基因的表達量均顯著高于對照組；第6天的侵染葉中ACP1基因增加量最為明顯，與對照組相比增加來約3倍；侵染第13 d的系統葉中，ACP1基因和SUS2基因表達量增加最明顯，增加了約1倍和1.5倍. 總體而言，侵染葉中WRI1相關基因的相對增加幅度略高于系統葉中相關基因的相對增加幅度(圖2). TRV-WRI1過表達后，在轉錄水平初步啟動了植物中與脂肪酸合成相關基因的表達.

圖2 TRV-WRI1過表達植株葉片中WRI1下游基因表達分析

3.3 TRV-WRI1過表達植株中油脂含量和成分的測定

為進一步探究WRI1基因對植物油脂含量積累的影響，本研究將TRV-WRI1和TRV空載(CK)侵染本氏煙草，分別在第7 d和第14 d取侵染葉葉片、系統葉葉片，測定油脂的成分和含量. 結果顯示，在侵染后第7 d，實驗組中的軟脂酸含量和大部分硬脂酸含量顯著增加. 以每克植物葉片中的油脂含量來分析，實驗組中的總油脂含量比對照組約增加16%. 侵染14 d后與對照組相比，實驗組中的部分硬脂肪酸含量顯著增加，總油脂含量比對照組約增加28%(圖3).

3.4 TRV-FDA2沉默植株中油脂含量的成分和測定

為進一步探究FAD2基因對植物油脂含量積累的影響，本研究將TRV-FDA2和TRV空載(CK)侵染本氏煙草，分別在第7 d和第14 d取侵染葉葉片、系統葉葉片，測定油脂的成分和含量. 結果顯示，在侵染后第7 d和第14 d，實驗組中的多不飽和脂肪酸含量顯著減少. 以每克植物葉片中的油脂含量來分析，實驗組中的多不飽和脂肪酸含量比對照組減少約25%. 在侵染后第14 d，與對照組相比，實驗組中的多不飽和脂肪酸含量顯著減少，相比對照組減少約24%(圖4).

圖3 TRV-WRI1過表達植株葉片中脂肪酸分析

圖4 TRV-FDA2沉默植株葉片中脂肪酸分析

種子油脂合成[11-12]. 利用TRV過表達系統，在本氏煙中過表達WRI1基因，隨著侵染后時間的延長，外源基因短期內在本氏煙中大量表達，在侵染后的第6 d和第13 d對WRI1的下游靶基因進行定量分析，實驗結果表明，WRI1的過表達啟動了其下游靶基因的表達，過表達植株中下游靶基因的含量顯著高于對照組. 從qRT-PCR結果可知，系統葉中WRI1下游基因的總體增加水平沒有侵染葉中的高，特別是與對照組相比，系統葉中的BCCP1、KAS1和Pl-Pkβ1基因的上升相對值沒有侵染葉中的高.

對其脂肪酸含量進行測定，總的侵染葉片脂肪酸含量第7 d的增加16%，第14 d系統葉增加28%. 與對照組相比，侵染葉中的軟脂酸、硬脂酸和大部分不飽和硬脂酸均呈顯著性增加，而系統葉中的軟脂酸和部分不飽和硬脂酸的含量僅呈上升趨勢，并沒有出現顯著性的差異. Yang等[13]在二穗短柄草中過表達BdWRI1誘導了糖酵解和脂肪酸生物合成相關基因的轉錄，使8 w齡葉片中的油脂含量增加了32.5倍，促進了葉片中脂肪酸的合成和標記的積累，然而，BdWRI1的過表達也導致了游離脂肪酸含量的增加，具有細胞毒性作用，導致細胞死亡.同時，利用TRV病毒載體沉默FDA2基因，脂肪酸測量結果顯示，在第7 d和第14 d，與對照組相比，多不飽和脂肪酸分別下降了25%和24%，且飽和脂肪酸含量差異不顯著，本實驗成功利用病毒載體沉默FDA2基因.

病毒載體瞬時侵染植物表達目的基因相比于穩定表達系統在時間上大大縮短，本實驗中，僅第6 d就檢測到了目的基因的表達，本氏煙中脂肪酸含量得到增加. 但是病毒載體的承載容量有限，不能包裝大片段的外源DNA基因，復制穩定性差，外源基因無法在植物細胞中穩定遺傳[14-15]；同時TRV病毒載體侵染的物種也有局限性，但是可以通過開發更多的病毒載體來解決這一問題. 后續研究可以同時在煙草葉片上利用TRV病毒載體，過表達WRI1和沉默FAD2基因，達到提高油脂總量和減少不飽和脂肪酸比例目的.