CEA陽性細胞系的鑒定及其荷瘤小鼠模型建立

呂開績，張麗芳，盧葉挺，王高卿，周新華

CEA是一種來源于機體內胚層上皮組織的糖蛋白，正常情況下人體血清中的CEA 含量極低。一旦正常機體出現腫瘤細胞異常增生時，CEA 會失去極性，之后過度表達。之后，在磷脂酶作用下，細胞表面的CEA 可以進入血清，導致血清CEA 的增加。目前臨床上常規檢測血清CEA 含量以動態觀察腫瘤的發生發展。CEA 可以在某些惡性腫瘤包括結腸直腸癌、胃癌[1-2]、肺癌[3-4]、胰腺癌[5]和其他癌癥中過度表達。其在癌細胞粘附、遷移和侵襲中起著重要作用。因此，CEA 已經成為免疫治療的靶標。本研究分別選取了人大腸癌細胞株HT-29、人胃癌細胞株M KN-45 及人宮頸癌細胞株Hela，利用RT-PCR、Wesern Blot 以及免疫熒光對3 種細胞株中的CEA 表達情況進行驗證；隨后利用3 種細胞分別建立荷瘤小鼠模型，為CEA 陽性腫瘤的發病基礎以及治療提供了腫瘤模型基礎。

1 資料與方法

1.1 材料及試劑 人大腸癌細胞株HT-29、人宮頸癌細胞株Hela 購自上海中科院細胞庫，人胃癌細胞株 MKN-45 購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。細胞培養基Basic RPMI-1640、DMEM、胎牛血清（FBS）、EDTA-胰酶購自Gibco 公司。CEA多抗購自abcam 公司。細胞培養用6 孔板、24 孔板、小號培養皿、細胞凍存管購自康樂實驗器材公司。4～5 周齡，健康未孕的雌性BALB/c-nu小鼠，體質量10～15 g，18 只，購自南京生物醫藥研究院，按照GB-14924.3-2001/GB14924.2-2001 營養標準配制小鼠飼料，IVC-II 型獨立通風系統，保持恒定溫度（22±2℃）和濕度（40%～70%），飲用水均為高壓滅菌水，每日光照與無光照各12 h 飼養于溫州醫科大學動物實驗中心SPF 級實驗室。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 設計CEA引物：上游引物序列為：5’ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTC3’；下游引物序列為：5’ATCTGACTTTATGACGTGTAGGG3’，由擎科生物公司進行合成。復蘇HT-29、MKN-45 及Hela 細胞，提取RNA：常規方法復蘇，傳代以上3 種細胞株，收集培養瓶內細胞，使用Trizol法提取RNA。提取的總RNA使用紫外分光光度計測量獲得A260 nm 和A280 nm 的吸光光度值。根據A260nm的吸光光度值計算獲得RNA濃度。RT-PCR：取2g RNA 進行逆轉錄，逆轉錄產物經過聚合酶鏈式反應擴增獲得目的基因CEA。PCR循環條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72℃1 min，35 個循環，72℃末延伸5 min。擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后成像拍照。

12.2 Western Blot 用六孔板分別培養3株細胞株，長至合適密度時，取出培養板后將其至于冰上，每孔加入1 ml的細胞裂解液（含10l 的PMSF），裂解30 min。之后用細胞刮棒將細胞集中于一側，用移液槍多次吹散細胞液后，收集細胞液至1.5 ml 離心管中。4 ℃下12000 r/min 離心5 min，將離心后的上清分裝用作跑膠的樣本。跑膠：每個孔以10l 的量加樣，電壓調整為30 V后，跑膠1 h，再將電壓調到100 V，繼續電泳直至蛋白marker 分開。剪好大小合適的PVDF 膜用于接下來的轉膜實驗，轉膜時間為15 min。用3%TBST 配置的牛奶封閉1 h，將牛奶吸出后，輕輕沖洗PVDF 膜，加入1∶1000 稀釋的CEA 多抗，37℃孵育2 h。后用TBST洗5 遍，每次5 min，然后加入1∶1000 HRP 標記羊抗鼠，37 ℃孵育1 h。加AB 顯色液室溫下5 min 顯色。

1.2.3 細胞免疫熒光 復蘇HT-29、MKN-45 及Hela細胞，在對應的細胞長至80～90%時，用胰酶消化完細胞，然后用1 ml的完全培養基（對應的培養基內加入10%的FBS）重懸細胞，用滴管加3 滴細胞懸液到24 孔板內。等至細胞長至合適密度，取出培養箱內的24 孔板，首先用PBS 清洗一遍細胞，然后在每個孔內加入200l 的多聚甲醛固定細胞，37℃放置15 min。用PBS洗一遍后加入0.3%的Triton，用20%的FBS 封閉細胞，37 ℃，2 h。敷一抗：棄去封閉液，首先用20%BSA以1∶1000 的比例稀釋CEA多抗，然后在24 孔板內添加200l 的一抗稀釋液，4℃放置過夜。敷二抗：棄去一抗，用PBST 洗3 次，然后在閉光條件下用PBST以1∶1000 的比例稀釋FITC標記的羊抗鼠，之后在每個孔內加入200l 對應的稀釋后的抗體，37℃放置2 h。用PBST 洗5 次，保持爬片內濕潤，在每個爬片上添加20l hochest，37℃染10 min，然后PBS 清洗。抗淬滅劑至載玻片上，然后把爬片上細胞這一面改至載玻片上，防止玻片上熒光的猝滅。后置于400 倍顯微鏡下進行拍片。

1.2.4 荷瘤小鼠腫瘤模型的建立 細胞復蘇，傳代以及凍存的方法如上.細胞接種：將處于對數生長期的細胞消化離心后，用無血清的1640 重懸細胞，利用細胞計數板，將其細胞密度調整為2×107/ml，在30 min內將細胞懸液接種到裸鼠的右側肩胛骨下，每只小鼠接種200l。接種細胞后，每天觀察荷瘤小鼠生長情況，每兩天進行拍照記錄并且測量腫瘤大小。測量腫瘤大小時，將測得到的腫瘤長徑記作為a，短徑記作為b，按V=0.5ab2的公式計算腫瘤大小[6]，以腫瘤體積和生長周數分別為坐標繪制的腫瘤生長曲線。

1.3 統計方法 采用SPSS20.0 軟件進行數據分析，計數資料采用2檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 株細胞中CEA的表達情況 HT-29、MKN-45細胞系在分子質量約400 bp 處可見單一條帶，而Hela 細胞系中未見明顯條帶。HT-29、MKN-45 細胞中有CEA 表達，而Hela 細胞則沒有CEA 表達。見封二彩圖3。

圖3 各細胞系中CEA 的表達情況

2.2 HT-29、MKN-45 及Hela 細胞中CEA 蛋白的表達情況 HT-29、MKN-45 細胞在180 kDa 可出現一條明顯的條帶，可見CEA 蛋白表達，而Hela 細胞中未見明顯的CEA 蛋白的表達。見封二彩圖4。

圖4 各細胞系中CEA 蛋白表達情況

2.3 各細胞系中CEA 天然蛋白的表達情況 孵育CEA 多抗的HT-29、MKN-45 的細胞，在胞膜的位置上出現明顯綠色團塊樣的熒光，而Hela 細胞中無綠色熒光出現，孵育PBS 的3 株細胞中均未出現明顯的綠色熒光。見封二彩圖5 及封三彩圖1。

圖1 PBS 與天然CEA 特異性結合的細胞免疫熒光

2.4 荷瘤小鼠模型的建立及成瘤情況 本組18 只裸鼠全部存活，且成瘤率為100%。MKN-45 荷瘤小鼠的成瘤潛伏期為（6.3±1.5）d，HT-29 成瘤潛伏期為（6.0±2.2）d，而Hela細胞的成瘤潛伏期為（10.0±1.6）d。MKN-45、HT-29 細胞的成瘤時間明顯短于Hela 細胞。MKN-45、HT-29 腫瘤長至200～300 mm3所需時間大約為2 周，而Hela 細胞需要4 周。見封三彩圖2 及圖1～2。

圖1 荷瘤小鼠腫瘤體積生長曲線

圖2 不同時期荷瘤小鼠腫瘤體積比較（*＜0.01）

圖2 各細胞系對應裸鼠成瘤圖

謝佩玲，張俐娜，何娜，等.骨髓間充質干細胞玻璃體腔內注射對外傷性視神經損傷的修復作用研究（見正文第1411 頁）

3 討論

1965 年，CEA首次從結腸癌患者組織中分離出來，目前已是常見的腫瘤標志物。CEA 在某些特定的惡性腫瘤中過度表達，尤其在消化道腫瘤中，其陽性率可達到90%，因此術前檢測CEA可對腫瘤患者的診斷、分期以及預后判斷有重要意義[7-8]。既往已有報道CEA 陽性細胞株為MKN-45[9]、HT-29[10]，但對其驗證缺少具體文獻支持。為了深入研究特定腫瘤的發生發展及其治療和相關預后，動物模型的挑選以及建立在此方面起著重要作用[11-12]。

本研究首先對利用RT-PCR 在基因水平對MKN-45 細胞、HT-29 細胞及Hela 細胞中的CEA 表達情況進行了驗證，發現CEA在前兩者細胞中表達，而在Hela 細胞中未見明顯表達。然后利用Western Blot 驗證了CEA 蛋白在以上3 株細胞系中的表達情況，結果和RT-PCR 結果相一致。而后利用免疫熒光技術對3 株細胞系中天然存在的CEA 蛋白進行驗證，發現在MKN-45、HT-29 細胞的胞質中出現了綠色斑點，說明CEA 在這兩種細胞的天然表達，而且存在于胞質中。

動物模型的建立對研究腫瘤的發生以及治療有重要的意義，理想的動物模型要求其發生部位、類型、病因、發生機制及其生物學行為等方面符合所研究的人類腫瘤。至今為止，荷瘤小鼠動物模型的建立主要分為4 大類，分別為自發性腫瘤模型、誘發性腫瘤模型、基因修飾腫瘤模型和移植性腫瘤模型[15]。相對而言，移植性腫瘤模型在以上4 種動物模型建立中具有其獨特的優點。首先，移植性腫瘤模型制作簡便、操作性好，荷瘤裸鼠模型成功率較高且對動物損傷小、死亡率低，研究的可重復性好。更為重要的是，裸小鼠的遺傳背景明確，性狀穩定，因免疫缺陷而不發生免疫排斥反應[16]，可進行體表部位腫瘤移植而形成體表移植瘤。經過預實驗的摸索后最終選擇細胞終濃度為2×107/ml 進行接種，所有荷瘤小鼠全部成瘤，成瘤率達到100%。通過觀察，筆者發現實驗中所有的裸鼠均未出現其他重要臟器轉移的情況。不足的是腫瘤長大后形狀趨于不規則，多數呈分葉狀，無法更精準的測量到腫瘤長徑和短徑。在今后的實驗的可能需要更加完善的接種方案。在接種后的早期，裸小鼠的局部皮膚長出小囊腫，而后囊腫逐漸增大，后長出實體瘤組織，隨著腫瘤體積的逐漸增大，裸鼠的體質量減少明顯。而后出現惡質病，腫瘤體積增長速度慢慢減緩。

由于對晚期惡性腫瘤的綜合治療，免疫治療已日益成為有效抗腫瘤研究的熱點。然而，目前，現有的動物模型不能準確地描述人類組織與腫瘤細胞之間的相互作用。此外，由于物種差異，在與人類相同的小鼠模型中重建免疫系統和微環境是一個艱巨的障礙。近年來，CEA 已經成為免疫治療的靶標。放射性標記的單克隆抗體已經被開發用于診斷和治療CEA 陽性腫瘤。盡管如此，單克隆抗體由于表現出緩慢的血液清除速率以及在肝臟的高攝取率對于其用作癌癥靶向探針是并不是十分理想的。較小的抗體片段，如抗原結合片段（Fab）和單鏈可變片段的，特別是納米抗體，由于它們的具有快速代謝和腫瘤的高攝取以及更好的藥代動力學這些特點使得他們近年來被用作腫瘤靶向探針。

與其他實驗相比，本實驗選取了較常見腫瘤的細胞株，從基因、分子、細胞水平分別驗證了各種細胞系中CEA 的表達情況，最后成功建立了荷瘤小鼠模型，為后期CEA 陽性腫瘤的免疫治療研究奠定了動物實驗基礎。