夫西地酸聯合抗生素抑制膿腫分枝桿菌的研究

何志群， 滕 飛， 高 超， 曾雪婷， 許馨月， 杜佳依， 李樹華， 曾菊梅， 汪 川

(1. 四川大學華西公共衛生學院/華西第四醫院 中毒、檢驗與精準防治研究轉化中心， 成都 610041; 2.四川大學生物治療國家重點實驗室， 成都 610041; 3.四川大學華西醫院人類疾病與免疫治療實驗室， 成都 610041; 4.陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心藥劑科， 重慶 400042)

1 引 言

膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus,M.ab)是一種具有多重天然耐藥性的快生型非結核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacteria, NTM)，引起人體嚴重的呼吸道、皮膚和粘膜感染.感染主要通過傷口(導管或其他暴露的表面)與環境或受污染的設備(手術器械等)直接接觸而發生[1-3].近年來，膿腫分枝桿菌在臨床感染的患者人數迅速增加，而可供選擇的治療藥物相對匱乏，已經成為了不可忽視的臨床問題.

已經有證據表明，膿腫分枝桿菌感染可能通過氣溶膠或接觸污染物的方式在人與人之間傳播[4-5].膿腫分枝桿菌因其固有的多重天然耐藥性導致對大多數常規抗生素及抗結核化合物廣泛耐藥，治療時藥物選擇比較局限.分離菌株的體外藥敏結果以及患者用藥史是選擇聯合用藥方案的重要參考：克拉霉素、阿奇霉素、頭孢西丁、阿米卡星、替加環素、亞胺培南/西司他丁等藥物對膿腫分枝桿菌具有較好的體外抑菌活性，臨床上選擇上述藥物聯合使用治療膿腫分枝桿菌感染.膿腫分枝桿菌藥敏試驗與臨床療效相關性不確定以及獲得性耐藥使得治療效果更不理想，治愈率僅30%～50%.其中新型大環內酯類藥物對大多數NTM治療比較有效，但膿腫分枝桿菌因其單拷貝靶標基因突變容易產生克拉霉素(23S rRNA基因)和阿米卡星(16S rRNA基因)的獲得性抗性突變，產生耐藥，導致治療失敗.頭孢西丁聯合治療快生分枝桿菌患者確實能夠提高治愈率，但在臨床菌株中檢測到該藥物敏感性下降[6-7].其他治療膿腫分枝桿菌的藥物在臨床上也存在不同程度的獲得性耐藥現象發生，導致患者無法獲得長期的痰培養轉陰結果以及臨床癥狀的改善[8].在目前的抗生素選擇下，膿腫分枝桿菌感染對大多數患者來說是一種難以治愈的慢性感染.因此尋找新的抗菌藥物策略包括老藥新用以及聯合用藥對于選擇抗膿腫分枝桿菌藥物尤其重要.

夫西地酸(Fusidic acid，C31H48O6)對革蘭氏陽性球菌尤其對葡萄球菌高度敏感，對某些革蘭氏陰性菌有一定的抗菌作用，也可抗厭氧菌感染，與其它抗生素無交叉耐藥性，常用于細菌性治療.多項體內外研究[9-12]表明夫西地酸聯用其他抗生素對葡萄球菌協同抗菌作用顯著，能夠明顯縮窄金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的耐藥突變選擇窗，抑制耐藥突變體的產生.另外夫西地酸聯用氨曲南或粘菌素對耐藥銅綠假單胞菌具有協同抗菌作用，夫西地酸聯用策略能夠一定程度逆轉菌株對藥物由耐藥變為敏感狀態[13-14].已經發現部分分枝桿菌對夫西地酸具有一定程度的敏感性，包括堪薩斯分枝桿菌，麻風分枝桿菌，以及結核分枝桿菌.計算機成功模擬預測分枝桿菌FtsZ (Filamentous temperature-sensitive mutant Z)是夫西地酸作用的有效靶點[15].

本研究首先開展了夫西地酸對膿腫分枝桿菌的抑菌活性研究，首次發現夫西地酸對膿腫分枝桿菌具有較好的體外抑菌活性；然后進一步開展了夫西地酸聯合阿奇霉素等藥物對膿腫分枝桿菌的抑菌活性研究，得到具有良好協同作用的兩種藥物組合，為臨床開發新的治療膿腫分枝桿菌感染藥物方案提供參考.

2 材料和方法

2.1 材 料

2.1.1 實驗菌株： 膿腫分枝桿菌標準菌株(ATCC 19977)；膿腫分枝桿菌臨床分離株7株(MAB-S1、MAB-S2、 MAB-S3、 MAB-R1、 MAB-R2、 MAB-R3、 MAB-R4)由四川大學華西第四醫院微生物室提供.

2.1.2 藥物與培養基 夫西地酸由四川大學生物治療國家重點實驗室余洛汀教授課題組提供；阿奇霉素(Azithromycin, C38H72N2O12，批號：C11104216)和頭孢曲松鈉(Ceftriaxone sodium, C18H17N8NaO7S3，批號：C11330323)均購自上海麥克林生化科技有限公司；貝達喹啉(Bedaquiline, C32H31BrN2O2，批號：B349211337769)購自美國APExBIO公司；7H9肉湯/瓊脂培養基(BD-Difco)均嚴格按照說明配制，4 ℃保存備用；Resazurin(麥克林生化科技)，二甲基亞砜DMSO (MP Biomedicals)，Tween 80 (Sigma-Aldrich).

2.2 實驗方法

2.2.1 膿腫分枝桿菌的準備 接種環挑取復蘇活化后的單個菌落在10 mL 7H9肉湯培養基中，37 ℃搖床恒溫振搖至菌液生長到對數生長期：以7H9肉湯培養基作空白對照管，測得OD在600 nm波長下吸光度約為0.5時，取菌液與新鮮7H9肉湯培養基稀釋制備菌懸液備用(約1×104CFU/mL).

2.2.2 藥物準備 夫西地酸溶解于DMSO，頭孢曲松鈉溶解于無菌水，阿奇霉素溶解于無水乙醇，三種藥物均配制為10 mg/mL的儲存濃度；貝達喹啉溶解于無菌水，配制為5 mg/mL的儲存濃度，經0.22 μm濾膜過濾除菌后-20 ℃凍存備用.

圖1 藥物結構示意圖Fig.1 The structure of Chemicals

2.2.5 最小殺菌濃度(MBC)測定 96孔板微量稀釋藥敏試驗培養后，分別取各藥物單獨作用和藥物聯用MIC90及MIC90以上三孔(無明顯細菌生長孔)的孔中50 μL菌液(包括生長對照菌液)作10-1、10-2、10-3、10-4稀釋后均勻涂布到無藥物的7H9瓊脂培養基上，一式三份，平板于5% CO2培養箱37℃倒置培養3 d，進行菌落計數.規定能夠殺滅培養基內99.9%的細菌(與無藥生長對照孔平板培養后菌落數比較)的最小藥物濃度作為該藥的最小殺菌濃度MBC.

2.2.6 膿腫分枝桿菌臨床株驗證藥物協同作用 采用2.2.4中方法先在96孔微孔板中測定夫西地酸與阿奇霉素、頭孢曲松鈉、貝達喹啉4種藥物單獨作用臨床膿腫分枝桿菌的體外抑菌作用，獲得各藥物針對臨床株的單獨MIC.結合各藥物聯用抑制標準株的結果，設置藥物兩兩聯用濃度梯度檢測聯用方案對臨床株的體外抑菌活性，比較膿腫分枝桿菌標準株與臨床株對聯合用藥方案的體外敏感情況.夫西地酸聯用阿奇霉素的濃度為：200/50、 100/25、 50/12.5、 25/6.25、 12.5/3.13、 6.25/1.56、 3.13/0.78、 1.56/0.39、 0.78/0.20、 0.39/0.10 μg/mL；夫西地酸聯用頭孢曲松鈉的濃度為：200/50、 100/25、 50/12.5、 25/6.25、 12.5/3.13、 6.25/1.56、 3.13/0.78、 1.56/0.39、 0.78/0.20、 0.39/0.10 μg/mL(個別不敏感菌株從200/400或400/200起始濃度向下2倍梯度稀釋)；夫西地酸聯用貝達喹啉的濃度為：200/3.13、 100/1.56、 50/0.78、 25/0.39、 12.5/0.20、 6.25/0.10、 3.13/0.05、 1.56/0.02、 0.78/0.01、 0.39/0.006 μg/mL；在96孔板上得到兩種藥物不同濃度的組合，按照上述操作測定各濃度組合下對膿腫分枝桿菌臨床株的生長抑制率.根據藥物單獨作用和聯用時MIC計算FICI值，評估分析不同藥物組合聯用對臨床株的抑菌效果.

3.1 藥物的最低抑菌濃度

微孔板二倍稀釋法測定MIC實驗結果表明，針對膿腫分枝桿菌的體外抑菌活性測定，單獨使用夫西地酸、阿奇霉素、頭孢曲松鈉和貝達喹啉時MIC50分別為6.25、 1.56、 1.56和0.78 μg/mL，MIC90分別為50、 6.25、 3.13及3.13 μg/mL (結果見圖2).

圖2 MABA法測定藥物單用對膿腫分枝桿菌的MIC結果

3.2 夫西地酸分別聯用三種藥物的協同效應

夫西地酸分別聯用阿奇霉素、頭孢曲松鈉和貝達喹啉對標準膿腫分枝桿菌的抑菌作用，隨著藥物聯用濃度不同而表現出不同的抑菌效果(結果見圖3).夫西地酸與阿奇霉素聯用表現出協同作用，當12.5 μg/mL夫西地酸聯用0.39 μg/mL阿奇霉素(或3.13 μg/mL 夫西地酸聯用1.56 μg/mL阿奇霉素)對膿腫分枝桿菌抑菌作用效果最佳，表現出協同的抗菌作用，夫西地酸聯用劑量降低為單用的1/4，同時阿奇霉素聯用劑量降低為單用的1/16.夫西地酸與頭孢曲松鈉聯用同樣表現出協同作用，當6.25 μg/mL夫西地酸聯用0.39 μg/mL頭孢曲松鈉對膿腫分枝桿菌抑菌作用效果最佳，表現出協同的抗菌作用，夫西地酸聯用劑量降低為單用的1/8，同時頭孢曲松鈉聯用劑量降低為單用的1/8；夫西地酸與抗結核藥物貝達喹啉聯用表現出相加作用，即6.25 μg/mL夫西地酸聯用 1.56 μg/mL貝達喹啉效果最佳，夫西地酸聯用劑量降低為單用的1/8，貝達喹啉聯用劑量降低為單用的1/2.

上述結果表明,夫西地酸與三種藥物聯用皆能夠表現出良好的協同或相加作用；三種組合中，夫西地酸與大環內酯類抗生素阿奇霉素或與頭孢菌素類藥物頭孢曲松鈉聯用協同抑菌效應良好，與二芳基喹啉類抗結核藥物貝達喹啉僅表現出相加作用，無協同作用(結果見表1).

圖3 棋盤格法測定夫西地酸聯用藥物對膿腫分枝桿菌的抑菌結果

3.3 藥物的最小殺菌濃度

實驗結果表明，夫西地酸與阿奇霉素、頭孢曲松鈉和貝達喹啉對標準膿腫分枝桿菌的MBC分別為50、12.5、3.13、6.25 μg/mL，四種藥物的單用MBC與MIC比值范圍在1.0～2.0，說明對標準膿腫分枝桿菌具有良好的殺菌活性.藥物聯用后MBC有所下降，夫西地酸聯用阿奇霉素后，夫西地酸的MBC降低4倍，阿奇霉素的MBC降低16倍；夫西地酸聯用頭孢曲松鈉后兩者的MBC皆降低8倍.結果表明夫西地酸聯用上述兩種藥物能夠增強其對膿腫分枝桿菌的殺菌作用，降低藥物的體外最小殺菌濃度，夫西地酸與阿奇霉素聯用能顯著降低阿奇霉素的最小殺菌濃度 (結果見表2).

表2 夫西地酸及三種藥物作用于膿腫分枝桿菌的MBC結果

3.4 聯合用藥對膿腫分枝桿菌臨床株的協同作用

夫西地酸與阿奇霉素、頭孢曲松鈉和貝達喹啉對膿腫分枝桿菌臨床株的最小抑菌濃度與標準株有所不同(結果見圖4).夫西地酸對S型臨床株的MIC90為100 μg/mL，對R型臨床株的MIC90為100～200 μg/mL，相較于標準株(50 μg/mL)有1～2倍升高；阿奇霉素對S型和R型的MIC90分別為3.13～50 μg/mL及1.56～6.25 μg/mL，表明阿奇霉素對R型菌落更加敏感；貝達喹啉對S型和R型的MIC90分別為0.20～0.78 μg/mL及0.10～0.20 μg/mL；當夫西地酸聯用阿奇霉素作用于膿腫分枝桿菌臨床株后，三個S型臨床株的FICI值為0.09～0.28，皆小于0.5，表現出協同作用.其中MAB-S1株夫西地酸聯用劑量降低為單用的1/32, 同時阿奇霉素聯用劑量降低為單用的1/4.類似地，針對MAB-S2株夫西地酸聯用劑量降低為單用的1/16, 阿奇霉素聯用劑量降低為單用的1/16.而針對MAB-S3株夫西地酸聯用劑量也降低為單用的1/16, 阿奇霉素聯用劑量則降低為單用的1/32;另外四個R型臨床株的FICI值為0.53～1.06，無協同作用.夫西地酸聯用頭孢曲松鈉對于膿腫分枝桿菌臨床株并未表現出針對標準株相似的協同作用，S型和R型的FICI指數均在0.5～1.5之間，表現出相加或無關作用.夫西地酸聯用貝達喹啉對于臨床株的FICI指數在1.12～1.5之間，僅表現出無關作用.

體外聯合藥敏結果表明夫西地酸與三種藥物聯用也能夠在膿腫分枝桿菌臨床株上一定程度表現出良好的協同或相加作用；其中尤其以夫西地酸與阿奇霉素聯用針對S型臨床株協同效應最好，極大地降低藥物濃度(最高達32*16倍).與頭孢曲松鈉、貝達喹啉僅表現出相加或無關作用，無協同作用(結果見表3).

圖4 膿腫分枝桿菌臨床株驗證夫西地酸聯用阿奇霉素的協同作用

表3 夫西地酸聯合三種藥物作用于膿腫分枝桿菌臨床株結果

4 討 論

NTM普遍存在于自然界土壤和水等環境中，人和動物均能被感染.全球NTM感染的發病率和患病率整體呈現動態增長趨勢，在部分國家和地區甚至超過結核發病率.我國鳥分枝桿菌復合群和膿腫分枝桿菌復合群是引起NTM肺病最常見的病原體[20-21].NTM肺病屬于慢性病，臨床癥狀與結核病相似，對抗結核藥物天然耐藥，容易被誤診誤治.膿腫分枝桿菌的固有廣泛耐藥性源于細胞壁的低滲透性、缺乏藥物活化系統、外排泵的誘導和廣泛的藥物修飾酶的產生[22-23].

夫西地酸是一種具有類甾體骨架的抗生素，從梭鏈孢酸脂球真菌中獲得，通過干擾延長因子G阻止核糖體易位抑制細菌的蛋白質合成發揮抑菌或殺菌作用.夫西地酸自從1962年被提取出來后被多個國家批準于臨床應用，不良反應輕，有組織穿透力強、藥物濃度高以及更安全可靠等特點高效抗菌，因其獨特的抑菌機制而不易與其它抗生素發生交叉耐藥.本文探究夫西地酸對具有天然耐藥性的膿腫分枝桿菌的抗菌活性，以及夫西地酸聯合阿奇霉素等藥物對膿腫分枝桿菌的協同抑菌作用.

阿奇霉素為十五元大環內酯類抗生素，和克拉霉素被認為是近20年來治療NTM病的重要新藥.其作用機制是通過阻礙細胞核蛋白 50S 亞基的聯結來抑制蛋白質合成從而發揮抑菌作用，膿腫分枝桿菌對其相對不易產生耐藥.本研究中夫西地酸單獨作用于膿腫分枝桿菌的MIC值較高，4株S型菌株(包括標準株)與4株R型菌株的MIC90分別為50～100 μg/mL 與100～200 μg/mL.阿奇霉素單獨作用于4株S型菌株與4株R型菌株的MIC90為3.13～50 μg/mL、1.56～6.25 μg/mL.S型菌株中兩株為阿奇霉素耐藥，4株R型菌株皆為阿奇霉素敏感或中度敏感.聯合用藥后標準株的夫西地酸與阿奇霉素MIC90降為1/4 (12.5 μg/mL)與1/16 (0.39 μg/mL)，臨床株的夫西地酸與阿奇霉素MIC90降為1/32 (3.13 μg/mL)與1/32 (1.56 μg/mL)；夫西地酸聯用阿奇霉素后可以極大地降低抗生素使用劑量，恢復阿奇霉素對耐藥膿腫分枝桿菌(MAB-S2、 MAB-S3)的敏感性.夫西地酸聯合阿奇霉素用藥組合對肺炎支原體以及耐藥肺炎支原體也表現出體外協同抑菌作用[24].膿腫分枝桿菌分為光滑型和粗糙型兩種菌落形態，單用時R型菌落相比S型菌落對阿奇霉素更敏感，推測可能與粗糙型膿腫分枝桿菌的細胞壁上糖肽磷脂類物質含量比較低，阿奇霉素藥物更容易進入胞內有關；其次夫西地酸聯用阿奇霉素僅在S型菌落上展現出優異的協同作用，可能因為夫西地酸作為類固醇抗生素，具有強大的脂溶性，良好的滲透力有助于阿奇霉素進入細胞內部作用于核蛋白發揮抑制膿腫分枝桿菌生長和繁殖的作用.同時R型菌落更容易高度聚集，群體抵抗阿奇霉素的能力相比S型更強；已有文獻[25]證明膿腫分枝桿菌R型菌落在人巨噬細胞中接受阿奇霉素處理后存活率較S型菌落顯著更高，本次實驗在臨床株上也同這一現象一致.

頭孢曲松鈉是第三代頭孢菌素類抗生素，屬于β-內酰胺抗生素，通過結合細菌的青霉素結合蛋白而抑制胞壁的合成達到抗菌作用.同樣的，頭孢曲松鈉單用MIC90為3.13 μg/mL，與夫西地酸聯合用藥后MIC90為0.39 μg/mL.頭孢曲松鈉與夫西地酸聯用，推測可能是頭孢菌素作用于膿腫分枝桿菌細胞壁造成胞壁破損，更利于夫西地酸進入胞內作用于核糖體發揮作用，但是這一協同現象并未在臨床株中觀察到.貝達喹啉是一種二芳基喹啉抗結核新藥，用于耐多藥結核病聯合治療，通過抑制分枝桿菌ATP合酶阻斷能量供應發揮作用.在體外對膿腫分枝桿菌有很好的抑菌活性，但其殺菌活性較弱[26-27]，本研究發現貝達喹啉單獨的MIC90為3.13 μg/mL，與夫西地酸聯合用藥后MIC90為1.56 μg/mL，該結果與文獻中趨勢一致，且與夫西地酸聯用也僅表現出相加的抑菌活性，無殺菌活性方面的改變，在臨床株中聯合用藥結果與標準株大致一致，僅觀察到相加與無關作用.

本研究結果可提示臨床疑似膿腫分枝桿菌除進行分子菌種鑒定以外，還需進行必要的分離培養以便菌落分型，單藥藥敏輔以聯合藥敏試驗，能為更有效地診斷和治療膿腫分枝桿菌感染提供重要參考.針對類似阿奇霉素等抗生素出現臨床分離菌株單藥耐藥情況時，可嘗試與夫西地酸等不同抗菌機制的抗生素聯用，一定程度上能夠恢復對該藥的敏感性，增加可供選擇的治療藥物，同時也降低各藥物使用劑量，減少單藥耐藥的產生.聯合用藥能為患者治療帶來除協同增加抗菌效能外更多的獲益：降低毒副反應以及減少單藥耐藥發生，避免無藥可治.老藥新用策略正在成為發現常見病和罕見病藥物的一種獨特方法[28].藥物再利用的優勢不僅是因為它們的細胞毒性、作用機制是已知的，而且這些化合物的大部分不良反應都已經得到充分的證明，同時還能極大地降低藥物開發成本.

夫西地酸及阿奇霉素的聯合用藥組合在體外對膿腫分枝桿菌標準株及臨床株均具有良好的協同抑菌活性，該抑菌效果仍需在大樣本臨床株中進行驗證，建立動物模型研究體內藥效、藥代試驗，以及開展完全隨機對照的臨床試驗來進一步觀察臨床效果，并最終為臨床治療膿腫分枝桿菌感染聯合用藥做出指導.