輪葉黑藻組培苗生長規律及煉苗研究

李琬騰 劉 杰 李典鵬 呂 喆 萬 云 冷 欣,3* 安樹青,3

（1 南京大學生命科學學院，江蘇 南京 210046；2 安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽 合肥 230000；3 南京大學常熟生態研究院，江蘇 蘇州 215501）

生態恢復和生態重建是中國濕地恢復的主要策略，人工干預可促進濕地生態系統的保護恢復(安樹青等, 2019)。沉水植物作為水生態系統的重要生產者，在修復水體污染中因具有去除水體中營養物質(Kufel et al, 2002; Clarke et al, 2001)、去除沉積物中污染物(Dai et al, 2014)、促進水體氮磷循環(Li et al, 2008)、加速生態系統的修復(朱江等, 2020)等作用而被廣泛使用。輪葉黑藻(Hydrilla verticillate)屬水鱉科黑藻屬，為多年生沉水植物，普遍生長于世界各處水域中，具有極強的耐污性(林連升等, 2005; Srivastava et al, 2016)，同時自身的凈化能力又使其成為水生植物恢復過程中的先鋒物種(Wei et al, 2004)。輪葉黑藻通過種子或營養繁殖體進行自我繁殖，且以斷枝進行營養繁殖較為普遍，但該繁殖方式存在占用空間資源大、成苗周期長及種苗價格高等問題(羅錢等, 2021)，利用植物組織培養技術可以對輪葉黑藻母本進行快速擴繁(Shasmita et al, 2018；孫敏杰等, 2012)，以解決我國輪葉黑藻野生苗來源不足的關鍵問題。

目前對輪葉黑藻組培苗的培養液成分、移栽基質及種植密度進行了大量的研究，形成了較為成熟的培養及種植體系(蔣金輝, 2007)。煉苗是使植株迅速適應環境，在定植前采取放風、降溫、適當控水等措施對幼苗強行鍛煉的過程。煉苗技術對于輪葉黑藻的生長發育至關重要，組培苗經過室內長時間的閉瓶生長，未經馴化直接移栽易出現品質不佳、倒苗死亡等現象。開蓋煉苗可以短期內使組培苗重建自身的獲得性抗逆性(Conrath et al, 2009)，例如張有鐸(2010)和柳躍等(2014)通過此方法提高組培苗移栽存活率。但目前國內外關于輪葉黑藻組培苗在整個生長階段生長生理指標變化及煉苗對其環境適應能力的影響研究較少。

通過探究輪葉黑藻組培苗的生長規律和環境適應能力，以期提高輪葉黑藻組培苗出苗品質及其快速適應新環境的能力，為輪葉黑藻組培苗產業化生產及工程化應用提供基礎數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

輪葉黑藻在實驗室中繼代培養1年，選取成熟健壯、長勢基本一致的植株，截取片段進行植物組織培養。

1.2 研究方法

1.2.1 植物組織培養試驗按23.7:150:20:1的對應比例將MS培養液與蔗糖、BA、IAA等物質混合，配置組培苗基礎培養液，pH值為5.6～5.8。將培養液置于高壓滅菌鍋內(121℃)滅菌30 min，再置于超凈工作臺中紫外殺菌30 min，待全部滅菌完成即可開始接種。其中組培苗的接種規格為：長2±0.2 cm、重0.2±0.01 g的成熟健壯輪葉黑藻片段。接種完成并封口后置于25℃恒溫組培室中進行培養，在此期間密切觀察組培苗生長情況以便及時剔除有菌苗。另一組組培架采取遮光處理以避免不同位置產生的光線干擾，固定光源與植物間距離為15 cm，燈與燈之間距離為10 cm。于培養后的第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d分別取樣，每次隨機取6瓶，3瓶用于測量干重、鮮重、莖長、分枝數等生長指標，3瓶用于測葉綠素(Chl)等生理指標。

1.2.2 開蓋煉苗試驗基于預實驗以及其他同類型實驗的參考(陳彩霞等, 2004; 柳躍等, 2014)，本實驗通過設置3種不同開蓋煉苗時間(1 d、3 d、5 d)及3種不同光 周期(6 h/d、9 h/d、12 h/d)進 行3×3正交實驗，每個處理重復3次。取閉瓶育苗完成且長勢健壯的輪葉黑藻組培苗作為實驗對象，將組培苗置于組培架內，對其進行9種不同條件的開蓋煉苗處理，處理完成后將苗置于育苗袋中進行室外馴化培養，馴化用水取自實驗當地公園湖水。室外馴化培養14 d后每個條件隨機選取3株組培苗，用于測量可溶性糖、可溶性蛋白及葉綠素等生理指標。

1.2.3 樣品指標測定方法鮮/干重測定方法為將待測輪葉黑藻樣品所有根、莖、葉均收集起來，洗凈后迅速用濾紙擦干測量鮮重(FW)，在60°C恒溫烘箱中24 h后測定生物量干重(DW)。葉綠素含量測定采用丙酮乙醇混合液法(張憲政, 1986)；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍比色法(王學奎, 2006)；可溶性總糖含量測定采用蒽酮法(李合生, 2006)。

1.3 數據分析與處理

采用SPSS軟件進行單因素方差分析、雙因素方差分析、person相關性分析，采用Origin進行線性回歸擬合，Graphpad prism軟件繪制柱狀圖。

2 結果與討論

2.1 組培苗生長生理指標分析

2.1.1 表型指標輪葉黑藻組培苗各表觀形態指標整體呈增長趨勢，并在培養25 d后，各指標均隨著組培時間的增加而顯著增加(P＜0.05)，干鮮重以及莖長等指標在第45 d分別增加了81.41%、157.72%、8.02%，分 枝 數 在 第35 d顯 著 增 加66.67%(表1)。組培苗培養初期，因剛接種至瓶內新環境下，組培苗處于初期生長遲緩階段，植物新陳代謝緩慢，故各項生長指標未出現顯著上升。而后期隨著組培苗對環境的不斷適應，光合作用不斷增強，逐步進入高速生長階段，這與謝翔(2020)對草莓組培苗的研究結果相同。此外，輪葉黑藻組培苗各生長指標之間出現了異速增長，其中分枝數最先發生顯著性變化，表明輪葉黑藻組培苗優先實現分支數的顯著增加而后再加速莖長、干鮮重等生長。

表1 輪葉黑藻組培苗表型指標變化Table 1 Changes of apparent type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.1.2 生理型指標輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb在組培育苗前35 d內始終處于下降趨勢，自第25 d起Chla顯著下降49.71%，Chlb顯著下降40.65%(P＜0.05)(表2)。可能由于組培苗處于緩苗期，這與陳磊(2019)對白芨苗組培研究的結果一致；也可能由于組培室內光照過強，輪葉黑藻通過減少自身Chla、Chlb含量來減少單位面積Chl酶活性從而避免光氧化(Shigenaga et al, 1994; Salin et al, 1991; Pascal et al, 2005)。緩苗期后輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb含量仍未上升，可能與瓶內沒有足夠的氮源供組培苗進行循環轉化有關(蘇敏, 2020)，而Chlb下降的原因可能是在植物體內Chlb往 往 由Chla轉 化 形 成(Rüdiger, 2002)。盡管實驗過程中輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb始終未呈上升趨勢，但其Chla/b在第45 d有顯著提升，Chla/b是評價植物葉綠素濃度吸光度值的可靠性標準，也是反映植物光合作用能力的關鍵性指標(Lee, 2019)，該指標的提高說明本實驗中組培苗的光合作用隨時間增加有所增強。

2.1.3 生長指標相關分析為探究輪葉黑藻組培苗生長發育過程中內部生理生態變化與其表型變化之間的相關關系，為生長曲線擬合提供依據，對輪葉黑藻組培苗干鮮重、莖長等生長指標與Chl等生理指標進行相關性分析(表3)。其中輪葉黑藻組培苗各生長指標與Chla、Chlb等生理指標之間呈顯著負相關(P＜0.05)，表明植物在生長發育時期不同生物指標之間存在一定差異性(許智宏等, 1998)，由表1、表2可知，輪葉黑藻各項生理性微觀指標優先于其表型等宏觀指標表現出顯著性差異。此外，不同于Chla、Chlb等生理指標，輪葉黑藻組培苗的Chla/b指標與其生長指標之間呈顯著正相關(P＜0.05)，其中鮮重與Chla/b的相關系數最高，達0.747，說明只有較高的Chla/b值，植物才能較好地進行光合作用及生長發育(金相燦等, 2008)。

表2 輪葉黑藻組培苗生理型指標變化Table 2 Changes of physiological type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.2 組培苗生長曲線擬合

由于輪葉黑藻組培苗干重含量較低(最小只有0.02 g)，容易因操作誤差而對其數據結果造成較大影響，且組培后期組培苗繁殖較快，分枝數、芽數與葉片數混雜難以分辨及測量，所以本研究以時間為自變量，鮮重為因變量，對組培苗的生長曲線進行擬合，能較大程度減少誤差。由表3的指標相關性分析可知，鮮重與其他表型指標之間存在極顯著相關性(P＜0.01)，以鮮重變化來替代其它類型指標的變化也具有一定的科學依據。

表3 輪葉黑藻組培苗各生長指標相關性分析Table 3 Correlation analysis of growth indexes of tissue culture seedlings of H. verticillata

為模擬預測輪葉黑藻組培苗生長發育狀況，本研究利用Logistic、Gompertz、Von Bertalanffy 3種模型對輪葉黑藻組培苗的生長情況進行模擬，擬合方程、擬合參數、R2以及拐點等值如表4所示。

表4 三種“S”型模擬表達式Table 4 Three "S" type simulation expressions

輪葉黑藻組培苗生長發育的實際擬合曲線如圖1所示，圖中黑色實心圓點代表實際鮮重測量值，3種擬合曲線在第15 d的擬合值均低于實際測量值，且存在較大誤差率，隨著育苗時間的增加，代表組培苗鮮重實測值的黑點較為均勻的分布在擬合曲線周圍，尤其第25 d和第35 d，實測值幾乎與3種模型的擬合曲線重合，說明模型在此階段可高度模擬植物生長動態規律。

圖1 輪葉黑藻組培苗生長曲線擬合圖Fig.1 Growth curve fitting of H. verticillata tissue culture seedlings

為進一步比較各階段不同模型擬合效果，表5將組培苗鮮重實測值與模擬數據之間進行對比。第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d時，Logistic模 型 擬合誤差率分別為54.05%、0.59%、4.26%、0.91%、0.15%。總體來看，隨著時間的增加，擬合誤差率逐步降低，曲線的擬合效果越好。分析原因可能是前期組培苗為適應新環境，擾亂了自身正常生長秩序，而后期通過自我調節適應新環境，恢復正常生長狀態(Smithers et al, 2019)。

表5 實測值與模型數據比較Table 5 Comparison of measured value and model data

2.3 組培苗開蓋煉苗生理指標分析

光周期為6 h/d和12 h/d時，開蓋時間不會引起組培苗可溶性蛋白含量的顯著變化(圖2a)。當光周期為9 h/d時，輪葉黑藻組培苗的可溶性蛋白含量在開蓋5 d時顯著上升了20.49%(P＜0.05)，同時其含量在該背景下達到了最大值1.73 mg/L。開蓋時間一定、光周期不同時，輪葉黑藻組培苗在9 h/d的光周期背景下，其可溶性蛋白含量均顯著高于其他兩組，當開蓋時間為1 d、3 d、5 d時，相較于同一開蓋時間下的6 h/d與12 h/d兩組，輪葉黑藻組培苗可溶性蛋白含量均值分別提高了34.07%、56.32%。說明在9 h/d光周期的條件下，開蓋馴化5 d可使輪葉黑藻組培苗獲得較高可溶性蛋白含量。當光周期為12 h/d時，與9 h/d組相比，該組可溶性蛋白含量均顯著下降，說明較長時間光照會降低輪葉黑藻組培苗的可溶性糖含量，與張愛玲(2009)對小麥的研究結果一致。孫歲寒等(2007)發現過長時間光照會影響藻細胞代謝抑制其生長，安彥君等(2016)也發現在24 h連續光照條件下，葛仙米的物質積累出現負增長，說明長時間光照會損害植物生長發育。

圖2 輪葉黑藻組培苗可溶性蛋白（a）/糖含量（b）Fig.2 Soluble protein of H. verticillata tissue culture seedling(a)/ Soluble sugar(b)

光周期為6 h/d和12 h/d時，隨著開蓋時間的增加，輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量逐步降低但未形成顯著差異(圖2b)。在開蓋時間相同、光周期不同的條件下，輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量均呈現6 h/d＞9 h/d＞12 h/d的趨勢，但差異不顯著。研究表明：可溶性糖等活性物質可以調節宿主植物滲透壓，間接促進植物生長發育(Ribaut et al, 2002)，植物可以通過調整葉片中可溶性糖含量來提高自身的抗逆性(蘇雅等, 2021; 李婧等, 2021)，故本實驗中長光周期(12 h/d)不利于輪葉黑藻組培苗環境適應能力的獲取。

3 結論

(1)在輪葉黑藻組培苗生長曲線擬合中，3種方程對其生長的擬合均具有較好效果，可一定程度上模擬其動態生長規律。46—48 d時間點附近是組培苗長勢最旺盛的階段，此階段及時移栽可以獲得長勢健壯的輪葉黑藻組培苗，從而避免過度培養帶來的出苗品質不佳及經濟損耗等問題。

(2)在輪葉黑藻組培苗開蓋煉苗過程中，煉苗條件對輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量影響不大，但對其可溶性蛋白影響較大，且在長光周期(12 h/d)煉苗背景下會顯著降低組培苗可溶性蛋白含量，為保證組培苗煉苗效果，應給予組培苗5 d開蓋露苗處理及9 h/d光周期處理。