激活α7 nAChR通過抑制慢性炎癥反應減輕飲食誘導的大鼠肥胖型高血壓*

馬度芳， 蔡 璐， 姜 萍， 李 曉， 王 詠△

（1山東中醫藥大學附屬醫院，山東濟南250014；2山東中醫藥大學，山東濟南250014）

肥胖型高血壓的發生涉及多種病理機制，包括胰島素和瘦素抵抗、脂肪組織炎癥、過度的交感神經系統和腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活等［1］。其中，代謝異常導致的中樞和外周組織中慢性低度炎癥反應狀態，引發交感神經過度激活，是肥胖型高血壓的重要病理機制之一［2］，也是目前開發新藥物的潛在作用途徑。

在肥胖早期，過多的營養物質，如葡萄糖、游離脂肪酸和氨基酸等可通過腦脊液滲入到下丘腦中，誘導下丘腦中的炎癥反應［3-4］。隨著肥胖的發生，外周組織中產生的促炎因子可反饋到大腦中，強化和維持下丘腦原有的炎癥反應［5］。下丘腦內側基底部是調節食欲、血壓和能量代謝的重要區域，該處IκB激酶 β/核因子 κB（IκB kinase β/nuclear factor-κB，IKKβ/NF-κB）促炎通路激活導致的慢性炎癥反應是誘導肥胖型高血壓的重要機制［6］。激活的促炎通路可誘導瘦素信號負性調節因子，如細胞因子信號轉導 抑 制因 子 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphotase 1B，PTP1B）的產生，兩者可阻斷瘦素在下丘腦中的傳導信號——Janus 激酶2/信號轉導及轉錄激活因子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）信號通路，導致瘦素抵抗［7］。在這種條件下，瘦素不能有效調節能量穩態，卻可通過激活磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路而激活交感神經，導致交感神經興奮釋放過多去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）而介導高血壓［8］。由此可見，下丘腦中瘦素抵抗可歸因于下丘腦內側基底部的促炎通路激活。抑制中樞炎癥反應可恢復下丘腦的瘦素信號敏感性，起到對抗肥胖和肥胖型高血壓的作用。

α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChR）參與的膽堿能抗炎通路在抵抗機體炎癥反應中起到重要作用，該抗炎途徑由迷走神經、神經突觸釋放的乙酰膽堿及分布在細胞表面的α7 nAChR 組成。當迷走神經興奮時可釋放乙酰膽堿，后者與免疫細胞表面的α7 nAChR 結合后可抑制 IKKβ/NF-κB 通路而減少白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子的產生，抑制炎癥反應［9］。研究已發現在下丘腦神經元和外周脂肪組織中存在大量的α7 nAChR［10］。給予尼古丁激活α7 nAChR 可減輕大鼠瘦素抵抗和胰島素抵抗［11］，提示激活α7 nAChR 減輕機體炎癥反應是治療肥胖及其并發癥的潛在作用靶點。據此，我們推斷對于肥胖型高血壓，激活中樞和外周α7 nAChR 可能減輕機體炎癥反應和中樞瘦素抵抗，從而阻止肥胖型高血壓的發生。

材料和方法

1 實驗動物

8 周齡 SPF 級雄性 Wistar 大鼠 45 只，體重（200±20）g，購于山東濟寧魯抗動物藥業有限公司，許可證號為SCXK（魯）2013-0001。大鼠飼養環境溫度為（22±2）℃，明暗時間為12 h/12 h，可自由飲水攝食。

2 實驗材料

α7 nAChR 拮抗劑 α-銀環蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT；Cat No.ab120542，Abcam）；α7 nAChR激動劑PUN-282987（Cat No.2303，Tocris Bioscience）；大鼠瘦素ELISA 試劑盒（Cat No. 10638R）和大鼠NE ELISA 試劑盒（Cat No. 10171R）購自Assay Biotech；大鼠IL-1β ELISA 試劑盒（Cat No. ab100768）、大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（Cat No.ab46070）、兔單克隆p-STAT3 抗體（Cat No.ab76315）、兔多克隆p-PI3K p85抗體（Cat No. ab182651）、兔多克隆α7 nAChR 抗體（Cat No. ab10096）、兔多克隆 p-IKKβ 抗體（Cat No.ab59195）和兔多克隆TNF-α 抗體（Cat No.ab6617）購自Abcam；兔多克隆p-NF-κB p65 抗體（Cat No.1075-1-ap，Proteintech）；小鼠多克隆IL-1β 抗體（Cat No.sc-1265，Santa Cruz Biotechnology）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）Ⅱ抗（Cat No.ZB2305）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）Ⅱ抗（Cat No.ZB2305）購自Zsbio。

3 實驗儀器

ELx50 型洗板機（BioTek）；ST8 型低速自動平衡離心機和 MultiskanGo 酶標儀（Thermo Scientific）；Axiovert 40 型倒置相差顯微鏡和ZEN 1.01.0 圖像分析軟件（Carl Zeiss AG）；LightCycler?480 實時熒光定量PCR 系統（Roche）；Mini-PROTEAN 垂直電泳儀和小型 Trans-Blot 轉印槽（Bio-Rad）；FluorChem Q 蛋白印跡成像和定量分析系統（Alpha）。

4 方法

4.1 動物分組及干預 動物適應1 周后，分為空白對照組（NF con 組，n=8）和肥胖模型組（n=37）。肥胖模型組給予高脂飲食飼養誘導肥胖動物模型，NF con 組給予普通飼料喂養。16 周后，體重、血壓較空白對照組大鼠平均值升高25%的高脂飲食大鼠即為肥胖動物［12］。將誘導的肥胖動物32 只隨機分為3組：模型對照組（HF con 組，n=10）、激動劑組（PNU組，n=10）和抑制劑組（α-BGT+PNU 組，n=12）。PNU組給予每日腹腔注射 PNU-282987（3 mg/kg［13］）；α-BGT+PNU 組每日腹腔注射 α-BGT（1 μg/kg［14］）和PNU-282987（3 mg/kg），且 α-BGT 均在給予 PNU 前30～40 min 給藥，與 PNU-282987 的給藥時程相同；NF con組和HF con組腹腔注射生理鹽水（1 mL）。共持續注射6 周。實驗所涉及的大鼠操作均得到山東中醫藥大學附屬醫院動物倫理委員會的審批。

4.2 監測血壓、進食量和體重 每周一上午測量各組大鼠體重。每周一分別測量各只大鼠24 h進食量一次，作為一周的每天進食量。每周周三～周五的上午7 點～11 點使用尾動脈加壓法測量各只大鼠清醒狀態下的收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和心率，連續測量至少3次，取3次平均值，每次測量間隔3 min。

4.3 動物處死和留取標本 于22 周后，大鼠禁食10 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉。腹腔抽取腹下腔靜脈血10～15 mL，靜置離心后取上清待測。體循環生理鹽水灌注后取下丘腦組織，參照De Groot 等［15］大鼠腦圖譜，剝離下丘腦內側基底部。分離出附睪脂肪，腹膜后脂肪和腎周脂肪并稱量，作為內臟脂肪總重。計算內臟脂肪總重與體重的比值。留取附睪脂肪和右側腎臟組織，待測。

4.4 HE 染色 取附睪脂肪組織固定后制作石蠟塊，切片后行HE 染色，進行鏡下分析，每組隨機取4～7個標本，每個標本取2個切片，每個切片取2～3個視野來統計脂肪細胞大小。

4.5 ELISA 檢測血漿和腎臟中NE 和瘦素水平 取出保存的血漿2 mL樣品，離心（15 000×g）后，檢測血漿中NE 和瘦素水平。取腎臟組織勻漿后取上清液，檢測上清液中NE 水平。取嚴格按照ELISA 試劑盒說明操作。

4.6 RT-qPCR 檢測下丘腦組織 LepRb、SOCS3 和PTP1B 的mRNA 表達水平 將下丘腦組織標本離心后，按說明書操作步驟，用Trizol 法提取組織內總RNA 并測定總RNA 濃度和純度。按PrimeScript RT逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，通過LightCycler?480 實時熒光定量PCR 系統進行檢測，以GAPDH 為內參照，數據采用 2-ΔΔCt法進行分析。LepRb 的上游引物序列為 5′-GAGAGGCTGCTGAAATCGTC-3′，下游引物序 列為 5′-GACTCCTGAGCCATCCAGTC-3′；SOCS3 的上游引物序列為 5′-CTTTACCACCGACGGAACCT-3′，下游引物序列為 5′-GAACTCCCGAATGGGTCCAG-3′；PTP1B 的上游引物序列為 5′-TTTCCACTACACCACCTGGC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CACTGATCCTGCACTGACGA-3′；GAPDH 的上游引物序列為 5′-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′，下游引物序列為5′-AAGGTGGAGAATGGGAGTT-3′。

4.7 Western blot 檢測下丘腦組織p-STAT3、p-PI3K、p-IKKβ、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 蛋白水平 提取下丘腦組織蛋白，BCA 檢測試劑盒檢測蛋白濃度，5%分離膠分離后，250 mA 轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Ⅰ抗（p-STAT3，1∶150 000；p-PI3K、NF-κB 和 IL-1β，1∶500；p-IKKβ，1∶1 000；TNF-α，1∶150）。4 ℃孵育過夜后洗滌，加入Ⅱ抗，孵育后洗膜，ECL 發光檢測，采用IPP 6.0 軟件對圖像進行掃描定量，計算各組蛋白表達的灰度值與內參灰度值的比值作為蛋白表達的相對含量。每個樣本的每個指標重復做3次，最后取其均值。

5 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析；數據以均數±標準差（mean±SD）表示。定量資料經Shapiro-Wilk 檢驗做正態分布檢驗，將不符合正態分布的數據轉換為其相應的自然對數以近似正態分布，經方差齊性檢驗后采用方差分析進行組間比較，組間兩兩比較采用Dunnett 檢驗或SNK-q檢驗；若經轉化后仍不符合正態分布，則選用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 激活α7 nAChR可阻止體重增加，減少脂肪堆積

各組大鼠給藥結束后，PNU 組死亡2只，α-BGT+PNU 組死亡 4 只，去掉死亡大鼠，最終 HF con 組、PNU 組和α-BGT+PNU 組納入實驗的數量各為8 只，NF con組為10只。

與NF con組比較，HF con組大鼠體重持續升高，在第6 周較NF con 組增加了44%［（603.4±58.1）gvs（419.0±36.0）g］；給予 α7 nAChR 激動劑 PNU-282987 治療6 周可顯著減輕高脂飼養大鼠體重，并降低進食量（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1A、B。此外，與NF con 組大鼠相比，HF con 組大鼠內臟脂肪重量和脂肪總重/體重增加（P＜0.01）；相比HF con 組，給予PNU-282987 后的PNU 組大鼠內臟脂肪重量和脂肪總重/體重降低（P＜0.01）；然而，同時給予 α7 nAChR 拮抗劑 α-BGT 可抵消 PNU-282987 的上述作用（P＜0.01），見圖1C、D。

Figure 1. The body weight（A），daily food intake（B），fat weight（C）and fat weight/body weight（D）in each group. W：week（s）.Mean±SD. n=8 in NF con group，PNU group and α-BGT+PNU group；n=10 in HF con group.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HF con group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs PNU group.圖1 各組大鼠的體重、每日進食量、脂肪總重和脂肪總重/體重

2 激活α7 nAChR可抑制脂肪細胞體積增大

如圖2 所示，HF con 組的脂肪細胞表面積顯著大于 NF con 組［（11 034±619）pixel2vs（4 329±225）pixel2，P＜0.01］；而PNU組的脂肪細胞表面積顯著小于 HF con 組［（7 005±1 019）pixel2vs（11 034±619）pixel2，P＜0.01］和 α -BGT+PNU 組［（7 005±1 019）pixel2vs（11 292±793）pixel2，P＜0.01］；HF con 組與α-BGT+PNU組比較無顯著差異。

3 激活α7 nAChR可減輕肥胖誘導的高血壓

HF con 組 大 鼠的 SBP 和 DBP 均高于 NF con 組（P＜0.01），在第 6 周 SBP 和 DBP 分別增加了 11%［（127.7±5.5）mmHgvs（141.8±5.4） mmHg，P＜0.01］和 17%［（108.0±2.6）mmHgvs（126.4±4.2）mmHg，P＜0.01］；給予PNU-282987 治療的大鼠SBP和DBP 在第2～6周均較HF con組降低（P＜0.05或P＜0.01）；而且，PNU 組大鼠的 SBP 在第 3～6 周也低于α-BGT+PNU 組（P＜0.01），DBP 在第 5 和 6 周時低于α-BGT+PNU組（P＜0.01），見圖3A、B。

Figure 2. HE staining of adipose tissues（scale bar=200 μm）and determination of adipocyte surface area. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs NF con group；##P＜0.01 vs HF con group；△△P＜0.05 vs PNU group.圖2 脂肪組織HE染色和脂肪細胞表面積

為了評估外周交感神經活性，我們檢測外周血和腎臟組織中NE含量，結果顯示HF con組大鼠腎臟中的 NE 含量均高于 NF con 組（P＜0.01）；PNU 組的腎臟中NE 含量低于HF con 組和α-BGT+PNU 組（P＜0.01），見圖3C。各組血液中NE 含量差異無統計學意義，見圖3D。

Figure 3. The blood pressure（A and B；n=8 in NF con group，PNU group and α-BGT+PNU group；n=10 in HF con group），and renal tissue（C；n=8）and blood（D；n=6）levels of NE in each group. Mean±SD.**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HF con group；△△P＜0.01 vs PNU group.圖3 各組大鼠血壓及腎臟組織和血液中NE水平

4 激活α7 nAChR抑制下丘腦中的炎癥反應

給予高脂飼養可增強下丘腦中的炎癥反應，HF con 組下丘腦組織中 p-IKKβ（P＜0.01）、NF-κB（P＜0.05）以及促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表達增加（P＜0.05）；給予 PNU-282987 可抑制下丘腦中 p-IKKβ、NF-κB、IL-1β 和 TNF-α（P＜0.05）；同 時 給 予 α7 nAChR 拮抗劑 α-BGT 可使 p-IKKβ、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 表達較PNU 組增加（P＜0.05 或P＜0.01），減弱PNU-282987的作用，見圖4。

5 激活α7 nAChR改善下丘腦瘦素敏感性

與NF con 組相比，HF con 組大鼠下丘腦中反映瘦素信號敏感的 p-STAT3 蛋白（P＜0.05）和 LepRb mRNA（P＜0.01）水平降低，而與瘦素抵抗有關的p-PI3K蛋白（P＜0.05）及瘦素信號負性調節因子SOCS3和PTP1B mRNA（P＜0.01）水平升高，且血漿中瘦素含量增加（P＜0.01）；與 HF con 組大鼠比較，給予PNU-282987 可增加 p-STAT3 蛋白水平（P＜0.05）和LepRb mRNA 水平（P＜0.01），并降低血漿中瘦素水平（P＜0.05），抑制下丘腦中p-PI3K 蛋白（P＜0.05）、SOCS3 mRNA（P＜0.01）和PTP1B mRNA（P＜0.05）水平；同時給予α7 nAChR 拮抗劑α-BGT 可減弱PNU-282987改善瘦素抵抗的作用，見圖5。

Figure 4. The protein expression of p-IKKβ and NF-κB（A）and content of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α（B）in hypothalamus tissues. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05 vs HF con group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs PNU group.圖4 下丘腦組織中p-IKKβ和NF-κB蛋白表達量及促炎因子IL-1β和TNF-α含量

討 論

動物實驗表明，長期營養過剩可增加中樞和外周中IKKβ/NF-κB 促炎信號介導的炎癥反應，是導致肥胖型高血壓的重要病理機制［6］。因此，抑制這種代謝性炎癥反應成為治療肥胖型高血壓的重要途徑。膽堿能抗炎通路的提出可從抗炎角度出發為防治肥胖及其相關并發癥提供參考資料［16］。

已有研究證明，激活膽堿能抗炎通路可通過激活α7 nAChR 而抑制IKKβ/NF-κB 促炎通路，減少炎癥反應［9］。本研究結果顯示高脂飲食誘導的肥胖大鼠的下丘腦p-IKKβ、NF-κB及IL-1β和TNF-α蛋白水平升高，提示肥胖時中樞炎癥反應增強。長期給予α 7 nAChR 激動劑 PNU-282987 治療可抑制 p-IKKβ 和NF-κB 表達，減少中樞促炎因子的產生；而當同時給予 α7 nAChR 抑制劑 α-BGT 可減弱 PNU-282987 的上述抗炎作用消失，這表明α7 nAChR 在對抗肥胖導致的炎癥反應中發揮重要作用，使用激動劑刺激α7 nAChR可抑制肥胖機體中樞炎癥反應。

脂肪細胞產生的瘦素通過JAK2/STAT3 信號通路作用于下丘腦中瘦素受體而起到抑制食欲的作用［17］。與此同時，瘦素可通過激活交感神經而增加能量消耗［18］。長期慢性炎癥可導致選擇性瘦素抵抗，即過多的瘦素不能有效的抑制食欲和促進能量消耗，但卻保留它對交感神經的興奮作用，從而導致心率和血壓升高［8］。肥胖時，機體內促炎通路IKKβ/NF-κB 激活可上調瘦素負性調節因SOCS3 和PTP1B的表達，后兩者可打亂瘦素在下丘腦中的JAK2/STAT3 轉導信號，誘導瘦素抵抗［19］。與 STAT3 信號通路相反，下丘腦中激活的PI3K 信號通路是導致交感神經興奮的關鍵信號通路，而在瘦素介導的能量代謝中起到較小的作用［20］。當JAK2/STAT3 轉導通路受到抑制時，過多的瘦素作用于下丘腦中的PI3K信號通路而引起交感神經興奮，從而導致血壓升高。因此，在肥胖中，炎癥導致的STAT3信號轉導降低和PI3K 信號通路增強是引起下丘腦瘦素抵抗，從而引起代謝紊亂和高血壓發生的重要信號途徑。本研究表明，高脂飲食誘導的肥胖導致血漿中瘦素水平升高，而下丘腦中LepRb mRNA 的表達降低；同時，下丘腦中 p-STAT3 降低而 p-PI3K 相對增加，SOCS3 和PTP1B 表達也增加。表明高脂飲食誘導的肥胖大鼠出現瘦素抵抗。給予PNU-282987 激活α7 nAChR 后抑制下丘腦中IKKβ/NF-κB 通路，可增加下丘腦中LepRb mRNA 和 p-STAT3 的 表 達 ，抑 制 p-PI3K 和SOCS3 mRNA 的表達，降低血漿中瘦素水平，表明給與α7 nAChR 激動劑PNU-282987 后可增加瘦素敏感性而改善瘦素抵抗。中樞瘦素敏感性的增加可降低中樞交感神經傳出，從而減少外周NE 含量，阻止交感神經介導的血壓升高。當同時給予α7 nAChR 抑制劑α-BGT 可減弱PNU-282987 的改善瘦素抵抗的作用，進一步提示激活α7 nAChR 可通過改善瘦素抵抗而抑制交感神經活性，降低血壓。該結果為首次利用飲食誘導的肥胖大鼠模型，證明刺激α7 nAChR可通過抑制慢性炎癥反應而改善瘦素抵抗介導的交感神經興奮，從而抑制肥胖導致的血壓升高。

Figure 5. The protein levels of p-STAT3 and p-PI3K（A），and the mRNA expression of LepRb，SOCS3 and PTP1B（B，D and E）in hypothalamus tissues，as well as the plasma level of leptin（C）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HF con group；△P＜0.05；△△P＜0.01 vs PNU group.圖5 各組下丘腦組織中p-STAT3和p-PI3K蛋白水平及LepRb、SOCS3和PTP1B mRNA表達，以及血漿中瘦素含量

由于本實驗需要長時間注射α7 nAChR 激動劑和抑制劑，操作難度較大，實驗過程中未專門采取中樞特異性給藥方式。因此，不能明確證明α7 nAChR激動劑的中樞直接抗炎作用。但從既往文獻看，研究發現腹腔注射PNU-282987（3 mg/kg 或 6 mg/kg）可減少創傷性腦損傷導致的血腦屏障通透性，降低蛛網膜下出血導致的腦損傷以及中樞神經炎癥反應［21］。表明全身給予PNU-282987可直接激活中樞α 7 nAChR 受體，減輕中樞性炎癥反應，這支持我們的研究結果。

綜上所述，在飲食誘導的肥胖大鼠中，使用激動劑刺激α7 nAChR 受體可抑制下丘腦中的慢性炎癥反應，改善下丘腦瘦素抵抗，從而抑制中樞交感神經興奮介導的血壓升高，阻止肥胖型高血壓的發生。