C3aR在調(diào)節(jié)人壁層腎祖細胞源性的足細胞再生中的作用和機制研究*

楊 靜， 葉璐霞， 王莎莎△

（1蘇州大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇蘇州215000；2浙江省臺州醫(yī)院，浙江臨海317000）

腎小球疾病是嚴重危害人類健康的疾病，腎小球硬化是各種腎小球疾病進展的共同結(jié)局。據(jù)統(tǒng)計，85%以上的終末期腎衰因腎小球疾病所致［1］。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，在維持腎臟的正常結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵作用。足細胞的損傷和數(shù)量減少是導(dǎo)致腎小球濾過屏障破壞，以及腎小球硬化的重要原因［2］。

成熟的足細胞為一種高度結(jié)構(gòu)化的終末期分化細胞，缺乏再生能力，受到損傷后不能靠其自身的增殖而得到補充［3］。腎祖細胞是體內(nèi)的多分化潛能細胞，其中研究得最多的是存在于包曼氏囊壁上的壁層腎祖細胞（CD24+CD133+parietal epithelial cell，CD24+CD133+PEC），它不僅可通過增殖實現(xiàn)自我更新，而且可分化為足細胞以補充其丟失［4-5］。CD24+CD133+PEC 主要分布于尿極包曼氏囊壁，其主要表型特征是表達干細胞標記分子CD24 和CD133［6］。

C3a 受體（C3a receptor，C3aR）是補體C3 裂解產(chǎn)物C3a 的受體，最早被發(fā)現(xiàn)表達于多種骨髓源性的免疫細胞，參與免疫細胞的趨化和激活。近年來有研究表明C3aR 也表達于包括腦、肝、肺和腎臟等多種器官中的固有細胞，表現(xiàn)出多種多樣的非免疫功能。一些研究提示C3aR 可能參與了包括糖尿病腎病和局灶節(jié)段性腎小球硬化在內(nèi)的多種腎臟疾病的病理過程［7-11］，但其確切分子機制未明。C3aR 在CD24+CD133+PEC 中的作用未明，本項工作通過構(gòu)建C3a 分泌性表達慢病毒并感染CD24+CD133+PEC，以探討C3aR 在CD24+CD133+PEC 的增殖及其向足細胞分化中的作用及可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞 CD24+CD133+PEC 從人腎臟組織標本中提取，標本來自臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）臺州醫(yī)院腎透明細胞癌患者切除的癌旁組織。患者納入標準：（1）病理確診為腎透明細胞癌；（2）術(shù)前未經(jīng)過輔助放化療。排除標準：（1）并發(fā)其他腫瘤；（2）合并原發(fā)性或繼發(fā)性腎小球腎炎。實驗流程和方法均已通過臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）臺州醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書，倫理委員會批準編號為K20191201。

1.2 藥品 維生素D3和全反式視黃酸購于Sigma。

1.3 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)液購于Gibco；EBM-2培養(yǎng)液購于Lonza；胎牛血清購于VWR；Trizol購于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa；SYBR Green 染料購于碧云天公司；PCR 引物由上海吉凱基因化學技術(shù)公司合成；CCK-8 試劑盒購于美侖生物公司；Wilms 腫瘤蛋白1（Wilms tumor protein 1，WT1）抗體、ERK1/2 抗體、p-ERK1/2 抗體購于 CST；E-cadherin 抗體購于 Proteintech；C3aR 抗體購于 Genetex；ELISA試劑盒購于Elabscience。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱、酶標儀（ThermoFisher Scientific）；凝膠成像系統(tǒng)（GE Healthcare Life Sciences）；激光共聚焦顯微鏡（ZEISS LSM800）。

2 方法

2.1 CD24+CD133+PEC 的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)向足細胞分化 用文獻報道的方法［12-13］取人腎組織皮質(zhì)標本依次通過 60 目、80 目、100 目和 150 目篩網(wǎng)，并于150目篩網(wǎng)上收集腎小球于含20%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)液中進行原代培養(yǎng)，并利用磁珠分選法篩選表達CD24 和CD133 單細胞克隆，得到CD24+CD13+PEC。CD24+CD133+PEC 向足細胞的誘導(dǎo)分化于分化培養(yǎng)液VRAD（含10%胎牛血清、100 nmol/L 維生素 D3 和 100 μmol/L 全反式視黃酸的 DMEM-F12 培養(yǎng)液）中進行。培養(yǎng)1～3 d，根據(jù)足細胞特異性標記分子WT1 的表達情況判斷是否完成足細胞的誘導(dǎo)分化。

2.2 C3a 分泌性表達載體的構(gòu)建和重組慢病毒包裝 用文獻［14］報道的C3a 分泌表達重組基因，構(gòu)建C3a 分泌性表達載體pCDH-CMV-C3a-EF1-CopGFPT2A-Pu，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝成C3a表達重組慢病毒。收集病毒原液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 病毒感染細胞 CD24+CD133+PEC 按細胞密度 4×108/L 接種于 6 孔板，將細胞分為 3 組：C3a 過表達組、空載體組（NC 組）和未感染組（CD24+CD133+PEC 組）。待細胞融合度達到70%時，C3a 表達重組慢病毒及空載體NC 重組慢病毒按照MOI 值為5 的比例稀釋病毒，加入8 mg/L 的Polybrene。轉(zhuǎn)染48 h后，以1∶3的比例接種于細胞培養(yǎng)瓶，并加入10 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。

2.4 ELISA 法檢測C3a 表達水平 根據(jù)人C3a ELISA 試劑盒說明書，檢測細胞培養(yǎng)上清液中C3a 的濃度。

2.5 CCK-8 法檢測細胞活力 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞重懸后以每孔1×104的密度接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，吸掉培養(yǎng)液，加入10 μL CCK-8 檢測液和 90 μL 培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱孵育 2 h，每組設(shè)置5 個復(fù)孔。用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度（A）值。

2.6 細胞免疫熒光染色 細胞爬片于預(yù)冷的4%多聚甲醛、4 ℃固定 20 min，PBS 洗滌后，0.1% TrionX-100 室溫透化 10 min，再經(jīng) 5%BSA 封閉 30 min，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后Ⅱ抗避光孵育1 h，DAPI染色5 min，滴加抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察，采集圖像。

2.7 羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色 細胞爬片于預(yù)冷的4% 多聚甲醛、4 ℃固定 20 min，PBS 洗滌后，0.1%TrionX-100 室溫透化10 min，羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色1 h，經(jīng) PBS 洗滌后 DAPI 染色 5 min，滴加抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察，采集圖像。

2.8 RT-qPCR 檢測 采用Trizol 試劑提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix（Perfect Real Time）合成 cDNA。將 cDNA、引物和SYBR Green 染料加入反應(yīng)體系中，按照試劑盒說明書進行RT-qPCR 檢測。RT-qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán) 40 個周期。C3a 的上游引物序列為5’-AAGTCGGCAAGTACCCCAAG-3’，下游引物序列為 5’-AGTTGCAGCAGTCCAGGAAG-3’；C3aR 的上游引物序列為 5’-TGGTGGCTGTCTTTCTTGT-3’，下游引物序列為 5’-CTGCCTTGCTTTCTTCCTA-3’；WT1 的上游引物序列為 5’-GAGCGATAACCACACAACG-3’；下游引物序列為5’-ATGCCGACCGTACAAGAG-3’。所有樣品重復(fù)檢測3次，2-ΔΔCt法計算相關(guān)基因的表達情況。

2.9 Western blot 檢測 細胞蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后制備樣品，電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜。5%牛奶室溫封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌后Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學發(fā)光儀檢測，ImageJ分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進行分析。正態(tài)分布連續(xù)變量用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，組間比較用t檢驗或單因素方差分析；非正態(tài)分布連續(xù)變量用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Man-Whitney 或Kruskal-Wallis 檢驗。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 原代提取CD24+CD133+PEC并鑒定

從人腎組織皮質(zhì)標本分離的腎小球接種后第3天在正置顯微鏡下觀察到腎小球周圍有細胞爬出；然后分別在第7 天和第10 天觀察到細胞數(shù)量增多；在第21 天觀察到細胞幾乎鋪滿培養(yǎng)皿，細胞胞體變圓且透亮（見圖1A）。磁珠分選法篩選CD24+CD133+PEC，并利用免疫熒光染色來鑒定CD24+CD133+PEC，呈綠色熒光的為 CD24+CD133+PEC（見圖1B）。

Figure 1. Isolation and identification of the primary CD24+CD133+ PECs. A：after the isolated glomeruli cultured for 3，7，10 and 21 days，the number of cells gradually increased，and the cell bodies became round and transparent（scale bar=200 μm）；B：immunofluorescence staining indicated that CD24 and CD133 were positive for CD24+CD133+ PECs and negative for the controls（scale bar=100 μm）.圖1 原代CD24+CD133+PEC分離及鑒定

2 誘導(dǎo)CD24+CD133+PEC向足細胞分化并鑒定

CD24+CD133+PEC 于分化培養(yǎng)液VRAD 中誘導(dǎo)向足細胞分化，如圖2 所示，未分化的CD24+CD133+PEC 胞體圓潤，細胞排列緊密，分化后的CD24+CD13 3+PEC 數(shù)量減少，且長出偽足。如圖3 所示，分別用Western blot、免疫熒光染色和RT-qPCR 在分化的3 d內(nèi)檢測了細胞中WT1 的表達，結(jié)果顯示分化后的細胞中WT1 均高于未分化的CD24+CD133+PEC，且在分化第2 天有最高的表達（P＜0.05）。通過細胞骨架染色觀察分化后的細胞形態(tài)變化，與未分化的CD24+CD133+PEC 相比，分化后的細胞胞體變大，且有偽足伸出，見圖4。

Figure 2. After the CD24+CD133+ PECs differentiation for 1，2 and 3 days，the number of cells gradually decreased and pseudopods emerged. Scale bar=200 μm.圖2 CD24+CD133+PEC分化前3天，細胞數(shù)量逐漸減少，細胞長出偽足

3 C3aR 在CD24+CD133+ PEC 向足分化過程中的表達變化

通過Western blot 在蛋白水平檢測未分化及分化 1～3 d 的 CD24+CD133+PEC 中 C3aR 的表達情況，圖 5A 提示 C3aR 蛋白在分化后 1、2、3 d 的細胞中的表達水平顯著降低（P＜0.05），圖5B～D提示通過免疫熒光染色和RT-qPCR 檢測細胞中C3aR 的表達情況均得到與Western blot相同的結(jié)果。

4 C3a分泌性表達慢病毒感染細胞并鑒定

經(jīng)嘌呤霉素篩選后的細胞于倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染情況，如圖6 所示，NC 組和C3a 過表達組均有較強的熒光。通過RT-qPCR 對C3a 的mRNA表達水平進行分析，C3a 過表達組中C3a 的mRNA 表達水平顯著高于 CD24+CD133+PEC 組和 NC 組（P＜0.01）。分離細胞培養(yǎng)液上清，通過ELISA 檢測上清中C3a 的含量，C3a 過表達組的C3a 的含量顯著高于CD24+CD133+PEC組和NC組（P＜0.01），見圖7。

5 C3a 過表達促進細胞增殖和并抑制其向足細胞分化

通過CCK-8 檢測細胞的活力，結(jié)果顯示，C3a 過表達組細胞的增殖能力較CD24+CD133+PEC 組和NC 組顯著增強（P＜0.01），見圖8A。通過Westernblot檢測細胞誘導(dǎo)分化第2天時WT1和E-cadherin的蛋白表達，C3a 過表達組的WT1 蛋白表達較CD24+CD133+PEC 組和 NC 組顯著降低，E-cadherin蛋白表達較CD24+CD133+PEC 組和NC 組顯著升高（P＜0.01），見圖8B～D。

6 C3a過表達激活ERK通路

通過Western blot 檢測在細胞誘導(dǎo)分化2 d 時ERK1/2 信號通路相關(guān)蛋白表達水平，C3a 過表達組p-ERK1/2 蛋白表達較 CD24+CD133+PEC 組和 NC 組顯著升高（P＜0.01），見圖9。

討 論

足細胞為附著在腎小球基底膜外側(cè)的臟層上皮細胞，與內(nèi)皮細胞、腎小球基底膜構(gòu)成腎小球濾過屏障［15］。與其他固有腎小球細胞相比，足細胞不能充分增殖以替代疾病中耗盡的細胞。近年的研究已證實了包曼氏囊壁中CD24+CD133+PEC 的存在，CD24+CD133+PEC 在特定病理生理條件下，可增殖并進而分化為成熟的足細胞來補償損失的腎小球足細胞。Miesen 等［4］和 Shankland［5］等通過體外分化實驗證實CD24+CD133+PEC 可增殖分化為腎小球足細胞。一些基于模型動物的研究顯示，CD24+CD133+PEC 增殖和分化異常可能是導(dǎo)致包括FSGS 等疾病由足細胞損傷最終進展到腎小球硬化的重要原因，而改善CD24+CD133+PEC 源性的足細胞再生可能是包括血管緊張素抑制劑在內(nèi)的一些藥物減少腎小球硬化的重要機制［4-5，16］。本研究在人腎臟組織中成功分離出干細胞標記分子CD24 和CD133 呈陽性的CD24+CD133+PEC，且具有增殖能力。

WT1 維持足細胞的分化狀態(tài)及其完整性，也是足細胞特異性標記分子［17］。在本研究中，我們將CD24+CD133+PEC在VRAD 分化培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示W(wǎng)T1 在分化后的細胞中高表達，且在分化第2 天表達最高，結(jié)合細胞骨架蛋白染色，表明足細胞誘導(dǎo)分化成功。

Figure 3. WT1 expression during the differentiation of CD24+CD133+ PECs. A：Western blot showed that the expression of WT1 increased during the differentiation process of which increased significantly in the 2 day group；B and C：immunofluorescence staining showed that the expression of WT1 increased during the differentiation process of which increased significantly in the 2 day and 3 day groups and the highest in the 2 day group（scale bar=20 μm）；D：RT-qPCR showed that the expression of WT1 increased during the differentiation process of which increased significantly in the 2 day and 3 day groups and the highest in the 2 day group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CD24+CD133+PEC group.圖3 CD24+CD33+PEC分化過程中WT1表達水平

C3aR 是補體C3 裂解產(chǎn)物C3a 的受體，近年來的研究表明，C3aR 表達于多種器官的固有細胞中，表現(xiàn)出多種多樣的非免疫功能。特別是其在系統(tǒng)發(fā)育、細胞分化、增殖和凋亡中均起作用［7，18-20］。有研究顯示，破骨細胞分泌C3a，通過C3aR 作用于成骨細胞，促進其分化［21］。C3a 刺激肝細胞增殖，逆轉(zhuǎn)肝細胞脂肪降解，增強肝功能［22］。此外在腎臟中，顯示抑制C3aR 可減輕糖尿病腎病患者腎小球纖維化［8］；在IgA 腎病中，阻斷C3aR 或C5aR 可以減少模型小鼠的蛋白尿和減輕腎組織損傷［9］；白藜蘆醇通過抑制C3aR減輕局灶節(jié)段性腎小球硬化［11］。然而，C3aR在CD24+CD133+PEC 向足細胞分化過程中的作用未明。我們的研究結(jié)果顯示，在CD24+CD133+PEC 向足細胞分化過程中，C3aR 表達降低。進而，構(gòu)建C3a分泌性表達慢病毒轉(zhuǎn)染CD24+CD133+PEC 并誘導(dǎo)其分化，結(jié)果提示C3a 過表達組細胞活力顯著增強、WT1表達顯著降低，上皮細胞標記物E-cadherin表達顯著升高，提示C3a 過表達促進了CD24+CD133+PEC的增殖能力并且抑制了CD24+CD133+PEC 的分化能力。

Figure 4. Cytoskeleton staining showed that after the CD24+ CD133+ PECs differentiation for 1，2 and 3 days，the cells enlarged with pseudopods protruding. Scale bar=20 μm.圖4 細胞骨架染色

Figure 5. C3aR expression during the differentiation of CD24+CD133+PECs. A：Western blot showed that the expression of C3aR decreased significantly during the differentiation process；B and C：immunofluorescence staining showed that the expression of C3aR decreased significantly during the differentiation process（scale bar=20 μm）；D：RT-qPCR showed that the expression of C3aR decreased significantly during the differentiation process. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CD24+CD133+PEC group.圖5 CD24+CD133+PEC分化過程中C3aR表達水平

Figure 6. Fluorescence staining showed strong fluorescence in CD24+CD133+PEC in both NC group and C3a overexpression group after lentivirus infection. Scale bar=100 μm.圖6 熒光染色顯示慢病毒轉(zhuǎn)染CD24+CD133+PEC后NC組與C3a過表達組均有較強熒光

Figure 7. C3a expression in CD24+CD133+PECs after lentivirus infection. A：RT-qPCR showed that the expression of C3a was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+PEC group and NC group；B：ELISA showed that the secretion of C3a was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖7 慢病毒轉(zhuǎn)染CD24+CD133+PEC后C3a的表達水平

ERK1/2 廣泛存在且功能多樣，其調(diào)控細胞周期進展、細胞增殖、分裂、轉(zhuǎn)錄、分化、衰老、死亡、遷移、突起延伸和黏附［23］。激活的ERK1/2 可以將細胞外刺激轉(zhuǎn)化為控制基因表達的細胞內(nèi)信號，從而調(diào)控細胞增殖和分化［24］。Eng等［25］證實ERK1/2通路活化是影響CD24+CD133+PEC 向足分化的重要因素，然而C3aR是否通過該通路起作用仍未可知。我們的研究結(jié)果顯示C3a 過表達組p-ERK1/2 表達顯著升高，結(jié)合WT1和E-cadherin的表達水平，提示C3a過表達可能通過激活ERK1/2通路抑制了CD24+CD133+PEC向足細胞分化。

綜上所述，C3aR 調(diào)控了 CD24+CD133+PEC 向足細胞的分化且可能通過ERK1/2 通路起作用。為足細胞損傷后修復(fù)提供了新思路，其具體的機制還有待進一步研究。

Figure 8. Viabiltiy and differentiation capability of CD24+CD133+PECs after lentivirus infection. A：CCK-8 showed that the proliferation capability was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group；B，C and D：Western blot showed that the expression of WT1 was significantly lower in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group，while the expression of E-cadherin was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group after differentiation for 2 days. Mean±SD. n=3.**P＜0.05 vs NC group.圖8 慢病毒轉(zhuǎn)染CD24+CD133+PEC后的細胞活力和分化水平

Figure 9. Western blot showed that the expression of p-ERK1/2 was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group after lentivirus infection and differentiation for 2 days. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖9 Western blot顯示慢病毒轉(zhuǎn)染壁層腎祖細胞并分化2 d后，C3a過表達組p-ERK1/2表達顯著升高