頂空毛細(xì)管GC法測定馬波沙星原料藥中6種溶劑的殘留量

董玲玲，汪 霞，楊 星，馬秋冉，于曉輝，趙富華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

馬波沙星(Mabofloxacin) 又名麻保沙星，化學(xué)名為9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-2,3-二氫-7H-吡啶-[3,2,1-ij][4,1,2]-苯并噁二嗪-6-羧酸，通過抑制細(xì)菌復(fù)制中所需的 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶II和IV而表現(xiàn)殺菌作用[1]，是一種動(dòng)物專用的第三代喹諾酮類抗菌藥物，抗菌譜廣，對絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抗菌活性[1-2]，且具有很高的生物利用度[3]，統(tǒng)計(jì)國內(nèi)現(xiàn)有企業(yè)馬波沙星原料的合成工藝，使用了包括甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯在內(nèi)的6種溶劑[4-6]，因此，根據(jù)《中國獸藥典》2015年版[7]及VICH[8]的相關(guān)規(guī)定，采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測定上述6種溶劑的殘留量。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A氣相色譜儀，配Agilent 7697A頂空進(jìn)樣器及FID檢測器，ChemStation色譜工作站;METTLER TOLEDO XS 205電子天平。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯均為分析純。N,N-二甲基甲酰胺為色譜純。馬波沙星原料來自兩個(gè)企業(yè)，企業(yè)1批號:171101、171201、171202；企業(yè)2批號：160919、161011、170306。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:DB-624毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm, 3.0 μm)； 載氣:高純氮; 初始溫度為40 ℃，維持10 min后，以每分鐘20 ℃的速率升溫至80 ℃，維持2 min，再以每分鐘30 ℃的速率升溫至200 ℃，維持5 min。以氮?dú)鉃檩d氣，線速為每秒24.1 cm，分流比為5∶1；進(jìn)樣口溫度為180 ℃；檢測器為火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度為250 ℃；頂空瓶平衡溫度為105 ℃，平衡時(shí)間為20 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品約0.1 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加N,N-二甲基甲酰胺1 mL，密封，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液配制方法 分別精密稱取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯適量，加二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1 mL中分別含甲醇0.3 mg、乙醇0.5 mg、乙腈0.041 mg、二氯甲烷0.06 mg、苯0.002 mg和甲苯0.089 mg 的混合溶液，精密量取1 mL，置頂空瓶中，密封，作為對照品溶液。

2.3 專屬性 溶劑空白：精密量取1 mL N,N-二甲基甲酰胺置頂空瓶中，密封，即得。取溶劑空白及2.2項(xiàng)下的對照品溶液和供試品溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖(圖1～圖4)。結(jié)果表明，空白溶劑無干擾峰出現(xiàn); 對照品溶液色譜圖中，各殘留溶劑分離度良好；兩個(gè)企業(yè)供試品色譜圖中，殘留溶劑出峰處無干擾。

圖1 溶劑空白色譜圖(DMF)Fig 1 Chromatogram of solvent(DMF)

圖2 殘留溶劑對照品溶液色譜圖出峰順序依次為甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯、甲苯、DMFFig 2 Chromatogram of six kinds of residual solventsThe peak outflows by methanol, ethanol, acetonitrile, dichromethane, benzene and toluene

圖3 供試品溶液殘留溶劑色譜圖(企業(yè)1)Fig 3 Chromatogram of Marbofloxacin draw material (sample1)

圖4 供試品溶液殘留溶劑色譜圖(企業(yè)2)Fig 4 Chromatogram of Marbofloxacin draw material (sample2)

2.4 檢測限和定量限 取對照品溶液加N,N-二甲基甲酰胺系列稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比約為3時(shí)的濃度，作為檢測限；以信噪比約為10時(shí)的濃度，作為定量限，結(jié)果見表1。

2.5線性和范圍 分別精密稱取6種殘留溶劑適量，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋使成每1 mL中含甲醇30.0 mg、乙醇50.0 mg、乙腈4.1 mg、二氯甲烷6.0 mg、苯0.02 mg 和甲苯8.9 mg 的對照貯備液，用N,N-二甲基甲酰胺逐步稀釋使成梯度濃度。分別精密量取上述稀釋溶液各1 mL，置頂空瓶中，密封，進(jìn)樣。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別進(jìn)行線性回歸，結(jié)果6種溶劑的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系(表1)。

表1 馬波沙星殘留溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限結(jié)果表Tab 1 Results of range, linearity, limit of detection and limit of quantification.

2.6 精密度 取2.5項(xiàng)下的對照貯備液0.1 mL至10 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯、甲苯6次進(jìn)樣峰面積的RSD結(jié)果分別為2.1%，3.0%，3.8%，2.8%，3.3%和4.9%，精密度良好。

2.7 重復(fù)性 取馬波沙星原料(企業(yè)1，批號171202) 制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，檢出甲醇含量的均值為0. 01%，RSD為0%，其余均未檢出。

2.8 準(zhǔn)確度 混合對照品溶液：取2.5項(xiàng)下的對照貯備液1 mL至10 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制3份。

分別取9份馬波沙星原料(企業(yè)1，批號171202)各0.1 g，依次精密加入上述各混合對照品溶液0.08、0.1、0.12 mL，配制成相當(dāng)于80%、100%和120%限度的混合對照品溶液各3份。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果為：甲醇的平均回收率為113.3%(RSD=6.8%)；乙醇的平均回收率為116.4%(RSD=3.7%)、乙腈的平均回收率為109.7%(RSD=4.0%)、二氯甲烷的平均回收率為115.6%(RSD=5.9%)、苯的平均回收率為103.3%(RSD=6.7%)、甲苯的平均回收率為115.3%(RSD=6.2%)。

2.9 穩(wěn)定性 取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液4份，分別于0、6、12和24 h按2.1項(xiàng)下方法測定，記錄6種殘留溶劑的峰面積，考察溶液的穩(wěn)定性。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯和甲苯峰面積的RSD分別為0.9%、1.0%、1.5%、1.6%、2.0%和0.9%，各待測成分色譜峰面積的RSD≤2.0%。說明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 供試品測試結(jié)果 取2個(gè)企業(yè)6批供試品，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 馬波沙星殘留溶劑結(jié)果表Tab 1 Results of residual solvents in Marbofloxacin draw material.

測定過程中使用的色譜柱為DB-624/30 m,0.53 mm,3.0 μm。

3 討 論

3.1 溶劑的選擇 研究之初擬采用較環(huán)保且經(jīng)濟(jì)的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液作為溶劑[9]，但其在乙腈和二氯甲烷出峰處有干擾，因此，又考察N’N-二甲基甲酰胺(DMF)、N’N-二甲基乙酰胺(DMA)和二甲基亞砜(DMSO)，考慮到DMF毒性相對較小，最終采用DMF作為溶劑。

3.2 頂空平衡時(shí)間和平衡溫度的選擇 因本法采用DMF為溶媒，沸點(diǎn)較高，為保證馬波沙星原料中的殘留溶劑能更好的釋放達(dá)到平衡，擬采用較高的平衡溫度，考察100、105、110、115 ℃，平衡15、20、25、30 min的殘留溶劑結(jié)果，結(jié)果表明：固定平衡溫度為105 ℃時(shí)，20 min之后隨平衡時(shí)間延長，供試品中殘留溶劑量無明顯增加，確定平衡時(shí)間為20 min；固定平衡時(shí)間為20 min，兩個(gè)企業(yè)供試品中乙醇和甲苯的檢出量隨平衡溫度增加而增加，在105 ℃之后趨于平衡，但企業(yè)1供試品隨平衡溫度增加而顏色加深明顯，為防止因供試品降解而產(chǎn)生乙醇，最終確定平衡溫度為105 ℃。

3.3 結(jié)果判定 根據(jù)VICH和《中國獸藥典》2015年版附錄規(guī)定，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯和甲苯的殘留限度分別為：不得超過0. 3%、0. 5%、0.041%、0.06%、0.0002%和0.089%[7-8]。實(shí)際測定過程中若殘留溶劑峰面積低于檢測限，判為未檢出；殘留量低于限度判為符合規(guī)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的6批供試品檢測結(jié)果均符合規(guī)定。

綜上所述，本方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)，可以用于馬波沙星原料藥中6種殘留溶劑的檢測。