黃連解毒顆粒對靶動物雞的安全性試驗

丁倚晴，李樹鵬，練家樂，劉夢杰，劉 舉，李子良，雍 燕，劉 翠，郭世寧*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省獸用中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，廣州 510642；2.恩平基龍實業(yè)有限公司，廣東江門 529400；3.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東云浮 527400)

黃連解毒顆粒處方源于《中華人民共和國獸藥典》中的黃連解毒散(由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥組成)，被視為清熱解毒的代表方，主治三焦熱盛之證[1]。臨床可用于治療豬的高熱綜合征、仔豬黃白痢、非典型新城疫和大腸桿菌混感等[2]。

黃連解毒散由大苦大寒的黃連等組成，其適口性很差，在臨床應(yīng)用時往往會導(dǎo)致豬等味覺敏感動物采食下降，用藥劑量難以得到準(zhǔn)確控制，影響疾病的防控效果。此外，中藥散劑僅是將藥材粉碎成細(xì)粉，但有效成分仍存留在細(xì)胞壁中，其在動物體內(nèi)發(fā)揮作用時，有效成分的溶出程度和速度亦將影響藥效[3]。散劑采用拌料給藥，消耗更多人力物力，不如飲水給藥方便快捷、成本低。綜合上述因素，將黃連解毒散經(jīng)過提取后制成水溶性的黃連解毒顆粒，將解決目前黃連解毒散的不足，提升藥效且便于臨床使用[4-5]。

本試驗按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《畜禽用藥物靶動物安全性試驗指導(dǎo)原則》[6]要求測定了黃連解毒顆粒對靶動物雞的安全性，旨在為今后黃連解毒顆粒新藥申報和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 黃連解毒顆粒由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司動物保健品廠生產(chǎn)。規(guī)格：每1 g相當(dāng)于原藥材1 g，每袋100 g，生產(chǎn)批號: 20190101。

1.2 試驗動物 1日齡黃羽肉雛雞100只(31.12±0.75 g)：飼養(yǎng)于廣東江門恩平基龍實業(yè)有限公司，試驗期間嚴(yán)格按照管理標(biāo)準(zhǔn)進行飼養(yǎng)。

1.3 儀器設(shè)備 AUX-120電子天平為日本島津產(chǎn)品。BS-380全自動生化分析儀為深圳邁瑞公司產(chǎn)品。微量移液器為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。ST16R高速冷凍型離心機購自德國Thermo公司。CX31RTSF型生物顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。TP020型組織脫水機，RM2235型石蠟包埋機、切片機均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.4 主要試劑 蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹膠均購自Solarbio公司。其他如PBS緩沖液、福爾馬林溶液為自行配制。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UREA)試劑盒均購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.5 動物分組與處理 適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，根據(jù)《獸用中藥、天然藥物臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》中對靶動物安全試驗的分組要求，選取健康活潑的雛雞 80 只，隨機分為四組，每組 20 只。根據(jù)該藥物劑量篩選試驗推薦的臨床給藥劑量，設(shè)置黃連解毒顆粒推薦劑量的1倍劑量組(3 g/L)、3倍劑量組(9 g/L)、5倍劑量組(15 g/L)。3個用藥組持續(xù)飲水給藥7 d；對照組飲水中不添加任何藥物。

2 觀察和測定指標(biāo)

2.1 臨床觀察、血常規(guī)和血液生化指標(biāo)測定 每日觀察各組試驗雞只精神狀態(tài)、采食情況、行為表現(xiàn)、糞便、呼吸情況，對異常情況進行記錄。分別于給藥前和停藥后第7天，逐只稱重，同時記錄飼料消耗量。于給藥前、給藥第7天及停藥后第7天，每組隨機選取8只雞經(jīng)翅下靜脈采血，測定血常規(guī)及血生化指標(biāo)。

采用人工血球計數(shù)法及比色法進行血常規(guī)的檢測：白細(xì)胞數(shù)目(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)、血紅蛋白數(shù)目(HGB)。血液生化指標(biāo)的檢測：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素(UREA)。

2.2 剖解變化、病理組織觀察和臟器系數(shù)測定 試驗期間出現(xiàn)與藥物有關(guān)的臨床癥狀或生理生化指標(biāo)明顯異常的動物均屠宰并進行尸體解剖學(xué)檢查，對異常的器官均進行系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查；如果未見異常的試驗，在停藥后第7天，各組試驗雞隨機選取8只于采血后進行剖檢，觀察心、肝、脾、肺、腎、法氏囊等主要臟器的病理變化，采集各臟器并稱重，計算臟器系數(shù)；同時取對照組和5倍劑量組臟器，經(jīng)福爾馬林固定后，進行組織病理學(xué)觀察。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 所有試驗數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進行處理后，采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行One-Way ANOVA分析，比較試驗在給藥前、給藥第7天、停藥后第7天，三個試驗組與空白對照組間各指標(biāo)差異顯著性，試驗數(shù)據(jù)的結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床表現(xiàn) 試驗期間，黃連解毒顆粒各劑量組和對照組試驗雞，活潑好動，采食、飲水及糞便均正常，未發(fā)現(xiàn)死亡病例和受試藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。

3.2 生長性能變化 由表1 可知，空白對照組、1倍推薦劑量組、3倍推薦劑量組、5倍推薦劑量組在平均日采食量、平均日增重量、料重比相互間無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組雞的平均日采食量、平均日增重、料重比Tab 1 Average daily feed intake, average daily weight gain and feed-weight ratio of chickens in each group

3.3 給藥前、給藥第7天及停藥后第7天血常規(guī)指標(biāo) 結(jié)果(表2)表明，給藥前、給藥第7天，黃連解毒顆粒各劑量組的WBC、RBC、HGB計數(shù)與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)；停藥后第7天， 5倍推薦劑量組WBC相比于空白對照組顯著降低(P<0.05)，該變化在正常范圍內(nèi)。

表2 黃連解毒顆粒對肉雞血常規(guī)指標(biāo)的影響Tab 2 Effects of Huang-Lian-Jie-Du granules on hematologic indexes in chickens

3.4 給藥前、給藥第7天及停藥第7天血液生化指標(biāo) 結(jié)果(見表3、表4及表5)表明：給藥前各組間ALT、AST、TP、ALBⅡ、TC、TG和UREA值無顯著差異(P>0.05)；給藥第7天、停藥第7天各劑量組ALT值相比于對照組顯著降低(P<0.05)，其它各項血液生化指標(biāo)與對照組比較均無顯著差異(P>0.05)。

表3 給藥前肉雞血液生化指標(biāo)Tab 3 Blood biochemical indexes of chickens in each group before administration

表4 給藥第7天黃連解毒顆粒對肉雞血生化指標(biāo)的影響Tab 4 The influence on blood biochemical indexes in chickens after 7 days administration

表5 停藥第7天黃連解毒顆粒對肉雞血生化指標(biāo)的影響Tab 5 The influence on blood biochemical indexes in chickens after 7 days withdrawal time

3.5 臟器指數(shù) 結(jié)果(表6)顯示：停藥第7天，黃連解毒顆粒各劑量組試驗雞的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肺臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)與對照組相比均沒有明顯差異(P>0.05)； 1倍推薦劑量組胸腺指數(shù)比空白對照組顯著增加(P<0.05)。

表6 停藥第7天黃連解毒顆粒對肉雞臟器指數(shù)的影響Tab 6 Effects of Huang-Lian-Jie-Du granules on organ coefficient in chickens after 7 days withdrawal time

3.6 病理變化 黃連解毒顆粒5倍推薦劑量組雞的組織病理學(xué)結(jié)果顯示，包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊在內(nèi)的主要器官均未見明顯異常病理變化(圖1)。

A1、B1、C1、D1、E1、F1：分別為心、肝、脾、肺、腎、法氏囊的空白對照組組織學(xué)切片；A2、B2、C2、D2、E2、F2：分別為心、肝、脾、肺、腎、法氏囊的5倍劑量組組織學(xué)切片。A1、B1、C1、D1、E1、F1：Control of heart，liver，spleen，lung，kidney，bursa of Fabricius；A2、B2、C2、D2、E2、F2：5 times dose of heart，liver，spleen，lung，kidney，bursa of Fabricius.圖1 組織病理學(xué)觀察 (HE 100×)Fig 1 Result of histopathological (HE 100×)

4 討論與結(jié)論

研究表明，黃連解毒湯具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道菌群和保護胃腸黏膜等作用，該方劑中的有效化學(xué)成分為黃芩素、黃芩苷、小檗堿(又稱黃連素)及梔子苷[7]。黃連解毒湯提取物可顯著降低MAPKs磷酸化，并抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和IκBα的降解，發(fā)揮抗炎作用[8]。該方劑對溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等均有較好的抑菌效果[9]，其中黃芩是發(fā)揮抑菌作用的主藥[10]。

本試驗采用黃連解毒顆粒1倍、3倍、5倍推薦劑量進行飲水給藥，結(jié)果顯示，黃連解毒顆粒各劑量給藥組雞臨床表現(xiàn)、飲食、糞便均正常，5倍劑量組雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊器官的剖檢及組織學(xué)檢查均未見眼觀病變。各劑量組平均日增重均高于空白對照組，料肉比均低于空白對照組，說明黃連解毒顆粒還發(fā)揮促進動物生長作用[11]，在一定程度上降低料肉比，提高經(jīng)濟效益。

ALT是肝臟受損的一項重要指標(biāo)[12]，給藥第7天、停藥第7天各劑量組ALT值相比于對照組顯著降低(P<0.05)，同時肝臟組織切片沒有觀察到器質(zhì)性病變，表明使用黃連解毒顆粒具有一定的保護肝細(xì)胞及抗損傷作用，這與黃芩苷及黃芩素對APAP誘導(dǎo)的肝毒性保護作用結(jié)果相同[13]。TC、TG值與脂代謝相關(guān)，給藥第7天，黃連解毒顆粒各劑量組TC、TG值均表現(xiàn)降低，這與小檗堿可通過增加肝臟低密度脂蛋白受體的表達來降低高膽固醇血癥患者的血漿膽固醇和甘油三酯的結(jié)果一致[14]。停藥后第7天， 5倍推薦劑量組WBC相比于空白對照組顯著降低(P<0.05)，所有血液指標(biāo)變化均在正常范圍內(nèi)。停藥后第7天，1倍推薦劑量組脾臟和胸腺臟器指數(shù)比空白對照組有相對增加，證實黃連素發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用[15]，且1倍推薦劑量給藥提高免疫的效果最好。

綜上所述，黃連解毒顆粒5倍推薦劑量連續(xù)給藥7 d對靶動物雞是安全的。