地克珠利在雞蛋中的殘留消除規(guī)律研究

霍美霞，孫 磊，侯旖璇，劉海燕，王 磊，黃玲利

(國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品獸藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

地克珠利(Diclazuril，DIC)是三嗪類新型廣譜抗球蟲藥，其化學(xué)名為氯嗪苯乙腈，在低劑量時(shí)能有效控制雞盲腸球蟲，破壞球蟲卵囊，在家禽養(yǎng)殖中廣泛使用[1]。DIC對(duì)雞常見球蟲類型均有良好的效果，如柔嫩、堆型、毒害、布氏、巨型、和緩艾美耳球蟲，抗球蟲作用因球蟲種屬不同略有差異[2]。研究結(jié)果表明，其抗球蟲效果優(yōu)于莫能菌素、氨丙啉、尼卡巴嗪等抗球蟲藥，具有高效低毒的特點(diǎn)，是目前混飼濃度最低的一種抗球蟲藥[3]。抗球蟲藥物的大量使用可能導(dǎo)致藥物原形或代謝產(chǎn)物蓄積于可食性動(dòng)物產(chǎn)品(組織、牛奶、雞蛋等)中，從而進(jìn)入到食物鏈中威脅人類健康。雞蛋是生活中常見的高營(yíng)養(yǎng)食物之一，我國每年生產(chǎn)并消費(fèi)世界40%左右的雞蛋，人均雞蛋消費(fèi)量約為世界水平的2倍[4]。在蛋雞產(chǎn)蛋期使用禁用藥物，未嚴(yán)格遵守休藥期和墊料或飲水中的藥物暴露，均會(huì)導(dǎo)致雞蛋中藥物殘留，造成食品安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)[5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道DIC在雞蛋中存在殘留的發(fā)生[6]。DIC臨床使用劑量用少，連續(xù)用藥后在雞體內(nèi)消除慢，僅含有5%的殘留物也需要長(zhǎng)達(dá)15 d的時(shí)間才能成為無殘留的雞蛋[7]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《食品安全國家 食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)中規(guī)定，家禽產(chǎn)蛋期禁用DIC[8]。然而，臨床實(shí)際應(yīng)用過程中因未及時(shí)觀察給藥時(shí)間，墊料、飼料及水源的交叉感染等原因都可能會(huì)導(dǎo)致雞蛋中的DIC殘留發(fā)生。由于DIC是批準(zhǔn)用于蛋雞養(yǎng)殖的藥物，只是禁止用于產(chǎn)蛋期。其食品安全風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)低于禁用藥，如果以零檢出判定蛋產(chǎn)品的安全性過于嚴(yán)苛，對(duì)蛋雞養(yǎng)殖會(huì)造成困擾。本試驗(yàn)擬建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)雞蛋中地克珠利含量的方法，通過研究地克珠利在雞蛋中的殘留消除情況，結(jié)合國際食品安全性評(píng)價(jià)規(guī)范，初步確定DIC在雞蛋中的最大殘留限量，并提出棄蛋期，為地克珠利在蛋雞生產(chǎn)上的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品(生產(chǎn)批號(hào)101831-37-2，含量99.8%)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；地克珠利溶液(批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字190752045，含量0.5%)，購自廣東萬士達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司；色譜純甲醇和乙腈購自西班牙Scharlau公司；分析純甲醇和乙腈購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀，配備Waters Quattro Premier XE質(zhì)譜分析儀。Avanti J-25型高速冷凍離心機(jī)，購自日本日立公司。JQ-3200型超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司。MILLIPORE IQ 7000型超純水儀，購自貝萊美生物科技有限公司。XW-80A微型渦旋混合儀，購自上海滬西分析儀器廠有限公司。微量移液器，200 μL/ 1 mL/ 5 mL，購自Eppendorf Research plus。PL203分析天平(Max=210 g，d=0.001 g)，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。SQP電子天平(Min=10 mg，Max=220 g，d=0.1 mg)，購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取體重約1.7 kg的30只健康高產(chǎn)白羽蛋雞，隨機(jī)分為空白組(5只)和給藥組(25只)，給予無抗菌飼料以及隨意飲水，環(huán)境溫度保持在25 ℃左右。每天監(jiān)測(cè)母雞生理狀況，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.4 給藥與采樣 0.5%地克珠利溶液用飲用水稀釋成1 mg/L，給藥組經(jīng)飲水給藥連續(xù)給藥12 d，空白對(duì)照組給予等量飲用水。自給藥當(dāng)天，每天收集雞蛋直至停藥后25 d。給藥組每天至少收集20枚雞蛋，空白對(duì)照組收集雞蛋樣本作為空白對(duì)照，所有樣品均質(zhì)后保存在-20 ℃冰箱中直至分析。

1.5 樣品處理 分別稱取均質(zhì)蛋清、蛋黃和全蛋雞蛋樣品1 g (精確到0.01 g)于10 mL 離心管中，精密加入乙腈溶液2.5 mL，渦旋3 min，超聲10 min，4500 r/min離心10 min，再用同樣的方法重新提取一次，將兩次提取的上清液合并后移至50 mL離心管中，加入5 mL正己烷去脂，取上清液備用。

凈化：OASIS PRiME HLB固相萃取柱(6cc,200 mg)無需活化，1 mL 80%乙腈水預(yù)洗后，取上述提取上清液2.5 mL，將其過柱，取1 mL濾液經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜過濾后，用UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.6 樣品分析

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column(2.1×50 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為乙腈；B相為超純水溶液；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表Tab 1 Gradient elution schedule

1.6.2 質(zhì)譜條件 采用ESI離子源，負(fù)離子(ESI-)模式掃描，多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 地克珠利物質(zhì)譜檢測(cè)的特征離子參數(shù)Tab 2 Characteristic ion parameters of diclazuril mass spectrometry

1.6.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 分別取空白全蛋樣品、蛋清及蛋黃樣品1 g加入適量地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中藥物終濃度為1、10、100、200、500 μg/kg，經(jīng)樣品前處理之后，進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.6.4 精密度和準(zhǔn)確度 分別取空白全蛋樣品、蛋清及蛋黃樣品1 g加入適量地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中藥物終濃度為2.5、10、50 μg/kg，經(jīng)樣品前處理之后，進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，計(jì)算回收率。基質(zhì)添加樣品分為5批，連續(xù)3 d測(cè)定計(jì)算日內(nèi)和日間變異系數(shù)。回收率計(jì)算公式(1)如下：

(1)

式中，X：試樣中待測(cè)物回收率；A：試樣峰面積；As:標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積；W：試樣體積(mL)；V：待測(cè)提取液的總體積(mL)。

1.6.5 靈敏度 本試驗(yàn)方法的靈敏度包括檢測(cè)限(Limit of detection，LOD)和定量限(Limit of quantification，LOQ)。LOD是指樣品中能夠檢測(cè)到的被測(cè)物的最低含量，LOQ是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度與精密度。將低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋，添加到各個(gè)空白組織中，經(jīng)樣品前處理之后，過0.22 μm濾膜進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。以信噪比(S/N≥3)時(shí)的待測(cè)物濃度定義為L(zhǎng)OD；以信噪比(S/N≥10)時(shí)待測(cè)物的濃度定義為L(zhǎng)OQ。

1.6.6 穩(wěn)定性 分別取空白全蛋樣品、蛋清及蛋黃樣品1 g加入適量地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中藥物終濃度為2.5、10、50 μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，經(jīng)樣品前處理之后分別于4 ℃條件下放置24 h，-20 ℃冰箱冷凍放置24 h，-20 ℃反復(fù)凍融3次，進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，計(jì)算峰面積和RSD值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

1.7.1 消除動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 將蛋清、蛋黃和全蛋中測(cè)得的地克珠利的色譜峰面積代入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到地克珠利在雞蛋中的殘留量。將三種雞蛋樣品中各時(shí)間點(diǎn)的地克珠利含量進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，將對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后藥物濃度與時(shí)間做回歸分析，進(jìn)行殘留曲線擬合，根據(jù)回歸方程lnC=lnC0-kt(C:任一時(shí)間點(diǎn)藥物濃度，C0：初始濃度，k：消除速率常數(shù))，計(jì)算地克珠利在三種雞蛋樣品中的消除方程C=C0ekt和消除半衰期t1/2(t1/2=0.693/k)。

1.7.2 最大殘留限量和棄蛋期 根據(jù)地克珠利預(yù)期用途和在適用的食用組織的食物消耗值中進(jìn)行ADI值的分配，計(jì)算地克珠利在雞蛋中的ADI值和初步理論限量值。根據(jù)雞蛋中地克珠利的初步理論限量值，代入公式(2)中計(jì)算雞蛋中安全濃度(Safe Concentration, SC)。

將安全濃度的值代入公式(3)計(jì)算最大殘留限量。

MRLe=SCe×Rm×Re

(3)

式中，MRLe指蛋中最高殘留限量(μg/kg)；SCe指蛋中安全濃度(μg/kg)；Rm指殘留標(biāo)示物與總殘留的比例(%)；Re指定量分析方法回收率(%)。

地克珠利在蛋黃、蛋清及全蛋樣品的殘留消耗速率不完全相同，參照雞蛋中地克珠利的臨時(shí)MRL，采用WT1.4軟件，以95%的可信限為標(biāo)準(zhǔn)，DIC在對(duì)三種雞蛋樣品中殘留量進(jìn)行線性回歸分析。樣品中DIC濃度高于MRL的時(shí)間段為棄蛋期。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低檢測(cè)限與最低定量限 依據(jù)3倍信噪比確定檢測(cè)限，地克珠利在雞蛋全蛋樣品，蛋清樣品及蛋黃樣品的檢測(cè)限均為0.5 μg/kg；依據(jù)10倍信噪比確定檢測(cè)限，地克珠利在雞蛋全蛋樣品，蛋清樣品及蛋黃樣品的定量限均為2.5 μg/kg。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，滿足地克珠利在蛋清、蛋黃和全蛋中殘留檢測(cè)的需要。

2.2 特異性和專一性 空白的雞蛋全蛋樣品、蛋清樣品和蛋黃樣品添加2.5 μg/kg(定量限濃度)的地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照已建立好的樣品前處理方法處理后上樣檢測(cè)，如圖1所示：DIC在2.3 min處出峰，且附近無雜峰出現(xiàn)，顯示出該方法的特異性良好，符合定量方法學(xué)考核要求。地克珠利的標(biāo)準(zhǔn)曲線及在雞蛋全蛋樣品基質(zhì)、蛋黃基質(zhì)、蛋清基質(zhì)線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，相關(guān)系數(shù)r>0.998，線性良好。

(a:空白蛋清；b:空白蛋黃；c:空白全蛋；d:蛋清加標(biāo)；e:蛋黃加標(biāo)；f:全蛋加標(biāo))(a: Blank egg white; b: Blank yolk; C: Blank whole egg; D: Egg white added DIC; E: Egg yolk added DIC; F: Egg added DIC)圖1 地克珠利在蛋清、蛋黃和全蛋中的色譜圖Fig 1 Chromatogram of diclazuril in egg white, egg yolk and egg

表3 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)Tab 3 The standard curve equation and correlation coefficient of diclazuril

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 方法的準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用日內(nèi)間變異系數(shù)表示，結(jié)果如表4所示：本方法在2.5～50 μg/kg添加濃度水平上的雞蛋樣品的平均回收率為75.90%～90.38%，地克珠利在全蛋樣品、蛋清樣品及蛋黃樣品的日內(nèi)變異系數(shù)分別為：3.23%～5.88%、4.12%～8.26%、7.20%～8.14%，日間變異系數(shù)分別為：4.00%～7.11%、4.62%～8.21%、7.01%～7.74%。本試驗(yàn)所建立的地克珠利在雞蛋樣品中的殘留檢測(cè)方法符合方法學(xué)考核要求，可用于地克珠利在雞蛋(全蛋、蛋清、蛋黃)中的殘留消除研究。

表4 地克珠利在全蛋、蛋清和蛋黃中的回收率和精密度Tab 4 Recovery and precision of diclazuril in whole egg, egg white and yolk

2.4 穩(wěn)定性 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液和在空白的全蛋樣品、蛋清樣品、蛋黃樣品添加2.5，10，50 μg/kg三個(gè)濃度水平的樣品的穩(wěn)定性如表5所示，在4 ℃條件下放置24 h，-20 ℃冰箱冷凍放置24 h，-20 ℃反復(fù)凍融3次的條件下，經(jīng)檢測(cè)地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品間的RSD值小于6.91%，蛋清加標(biāo)樣品間的RSD值小于7.36%，蛋黃加標(biāo)樣品間的RSD值小于6.36%，全蛋加標(biāo)樣品間的RSD值小于8.11%。結(jié)果表明，地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液、蛋清加標(biāo)樣品、蛋黃加標(biāo)樣品和全蛋加標(biāo)樣品的穩(wěn)定性良好。

表5 地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品穩(wěn)定性Tab 5 Diclazuril standard solutions and stability of samples

2.5 地克珠利在雞蛋中的殘留消除特征 蛋雞連續(xù)12 d給藥后，在12 d時(shí)全蛋樣品的最高濃度，濃度為229.54±1.09 μg/kg；停藥后3 d時(shí)，觀察到DIC濃度下降為164.85±3.61 μg/kg。停藥14 d時(shí)，DIC殘留濃度降低至一個(gè)較低的水平(16.11±0.57 μg/kg)，停藥21 d后檢測(cè)不到DIC存在，全蛋中消除半衰期為T1/2為1.78 d；蛋清中DIC的分布相對(duì)于蛋黃較低，12 d時(shí)殘留濃度最高，為88.12±2.79 μg/kg，停藥10 d時(shí)降至較低的殘留水平(12.53±0.38 μg/kg)，消除半衰期為T1/2為6.93 d，第14天時(shí)蛋清樣品中檢測(cè)不到DIC存在；監(jiān)測(cè)到蛋黃的最高殘留濃度為311.02±4.46 μg/kg(給藥后第12天)，殘留消除過程較為緩慢，消除半衰期為T1/2為2.57 d，第14天時(shí)降至較低的濃度(26.04±2.45 μg/kg)，第21天后檢測(cè)不到DIC(表6)。

表6 雞蛋樣品中地克珠利殘留量(n=10)(μg/kg)Tab 6 Diclazuril residue in egg samples(n=10)(μg/kg)

DIC在蛋清、蛋黃和全蛋樣品中的消除參數(shù)及消除曲線如表7和圖2所示。

表7 雞蛋中地克珠利的消除參數(shù)Tab 7 Elimination parameters of diclazuril in eggs

圖2 地克珠利在雞蛋中的消除曲線Fig 2 The elimination curve of diclazuril in eggs

2.6 最大殘留限量和棄蛋期推算

2.6.1 ADI值的確定和分配 GB 31650-2019中規(guī)定地克珠利的ADI值為0.03 mg/kg.bw。ADI的分配根據(jù)藥物預(yù)期用途和每個(gè)組織的食物消耗值在適用的食用組織中進(jìn)行劃分。

WHO推薦的食物消費(fèi)系如下：一個(gè)60 kg體重的人，一天動(dòng)物性食物消費(fèi)量：哺乳動(dòng)物或禽肉500 g(其中：肌肉300 g，肝臟100 g，腎臟50 g，脂肪50 g)；或者魚肉300 g。另加奶 1500 g，雞蛋100 g，蜂蜜50 g。將ADI值(100%)按比例分配到各種食品動(dòng)物的可食性組織中。

根據(jù)藥物批準(zhǔn)使用的動(dòng)物不同，應(yīng)將ADI值在不同組織中分配：如果藥物批準(zhǔn)用于肉牛、豬、肉禽，則只考慮分配至肌肉+脂肪+肝+腎中；如果藥物還批準(zhǔn)用于奶牛和/或奶羊，則還要考慮分配到奶中，即肌肉+脂肪+肝+腎+奶；如果藥物還批準(zhǔn)用于蛋禽，則還要分配到蛋中，即肌肉+脂肪+肝+腎+蛋；如果藥物還批準(zhǔn)用于蜜蜂，則還要分配到蜂蜜中，即肌肉+脂肪+肝+腎+蜂蜜；如果藥物同時(shí)批準(zhǔn)涉及以上所有的動(dòng)物，則應(yīng)將全部ADI值分配到所涉及的上述組織和產(chǎn)品中，即肌肉+脂肪+肝+腎+奶+蛋+蜂蜜。

每種可食性組織中ADI的分配比例原則上等于該組織的推薦消耗量與批準(zhǔn)動(dòng)物的推薦可食性組織總量的比值，也可根據(jù)具體情況酌情分配。地克珠利ADI值為30 μg/kg體重，并且批準(zhǔn)使用于畜禽，因此，ADI的分配值考慮畜禽肌肉300 g、肝臟100 g、腎臟50 g、脂肪50 g和雞蛋100 g。據(jù)此，分配給雞蛋的ADI值應(yīng)為根據(jù)藥物的ADI值與食物分配系數(shù)，計(jì)算出地克珠利在雞蛋中的初步理論限量值：

2.6.2 安全濃度計(jì)算 安全濃度(Safe Concentration, SC)是指食品動(dòng)物用藥后，動(dòng)物性產(chǎn)品任何可食用部分允許人終生每日攝入且不超過ADI的藥物總殘留量。每種可食性組織中安全濃度的計(jì)算均基于一個(gè)60 kg的成年人每日攝入WHO推薦的食物消費(fèi)量，同時(shí)考慮ADI的分配比例，雞蛋中安全濃度為：

2.6.3 臨時(shí)MRL標(biāo)準(zhǔn)建議 鑒于我國規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期禁止使用地克珠利，現(xiàn)有文獻(xiàn)未能提供蛋中殘留標(biāo)示物占總殘留的比例，按FDA推薦的主要代謝物判定標(biāo)準(zhǔn)10%進(jìn)行保守估計(jì)，制訂地克珠利在雞蛋中的臨時(shí)MRL標(biāo)準(zhǔn)。

MRLe=SCe×Rm×Re=3000×10%×80%=
240(μg/kg)。

其中，MRLe指蛋中最高殘留限量(μg/kg)；SCe指蛋中安全濃度(μg/kg)；Rm指殘留標(biāo)示物與總殘留的比例(%)；Re指定量分析方法回收率(%)。為便于實(shí)際應(yīng)用，將MRL進(jìn)行取整。因此，建議雞蛋中地克珠利的臨時(shí)MRL為240 μg/kg。

2.6.4 棄蛋期 參照雞蛋中地克珠利的臨時(shí)MRL為240 μg/kg，蛋清和全蛋樣品中地克珠利的濃度低于240 μg/kg，因此，以蛋黃樣品進(jìn)行棄蛋期分析。采用WT1.4軟件，以95%的可信限為標(biāo)準(zhǔn)，MRL設(shè)為240 μg/kg，曲線擬合結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，自給藥第5.11天開始，截止到停藥第7.38天，蛋黃中地克珠利的含量均超過MRL，因此，棄蛋期從給藥第5天至停藥第8天，共16 d。

(a:給藥期；b:停藥期)(a: Administration period;b: Withdrawal period)圖3 地克珠利在雞蛋的棄蛋期擬合圖Fig 3 Diclazuril in the off-drug period of eggs

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 目前，地克珠利的色譜條件在多篇文獻(xiàn)中均有報(bào)道，侯軒等[9]采用0.2%甲酸水：乙腈(70∶30，V/V)的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，樣品運(yùn)行時(shí)間為12 min。陳彤等[10]采用0.1%甲酸水：甲醇(90∶10，V/V)的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，樣品運(yùn)行時(shí)間為6 min。為了達(dá)到快速檢測(cè)雞蛋中地克珠利含量的目的，本研究?jī)?yōu)化了樣品運(yùn)行時(shí)間， 在4 min內(nèi)完成雞蛋中地克珠利含量的檢測(cè)。同時(shí)，本研究中比較了不同流動(dòng)相相對(duì)分離度、峰形、靈敏度等影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水相的酸堿度對(duì)地克珠利的分離影響不大，對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)值也無明顯影響，加入甲酸并沒有提高響應(yīng)值。有機(jī)相用乙腈比用甲醇時(shí)地克珠利峰形更好。因此，本研究采用乙腈-水作為流動(dòng)相體系。

3.2 樣品提取與凈化 雞蛋是磷脂含量最高的食物之一，此外還含有大量的脂肪，極大干擾目標(biāo)化合物的分析。目前，國內(nèi)外關(guān)于地克珠利的提取與凈化方法有許多報(bào)道[6,9,11-14]，提取試劑一般為乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙腈和乙酸乙酯(5∶2)混合溶液。本試驗(yàn)比較了不同提取劑對(duì)樣品回收率的影響，結(jié)果表明甲醇提取效果較差，回收率較低，為45%～50%，使用乙腈和乙酸乙酯提取，回收率為70%～95%，但乙酸乙酯提取雜質(zhì)較多，影響后續(xù)凈化步驟。而乙腈能夠有效沉淀蛋白，防止樣品基質(zhì)中雜質(zhì)堵塞固相萃取柱，因此選擇乙腈作為樣品提取液。同時(shí)，本研究比較了OASIS HLB固相萃取柱和OASIS PRiME HLB固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明，OASIS HLB小柱的凈化效果較弱，回收率為55%～60%，并有雜峰干擾，無法有效地去除蛋黃樣品中的磷脂和脂肪，凈化后的液體渾濁，對(duì)儀器有損害作用。OASIS PRiME HLB小柱具有步驟簡(jiǎn)單、洗脫液清澈、凈化快速的優(yōu)勢(shì)，能有效去除雞蛋樣品中的磷脂和脂肪等雜質(zhì)，回收率在80%左右。因此，OASIS PRiME HLB(6cc,200 mg)固相萃取柱凈化效果更好。

3.3 地克珠利在雞蛋中的殘留消除規(guī)律 參照《獸藥殘留試驗(yàn)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》及臨床推薦給藥劑量制定地克珠利給藥12 d的試驗(yàn)方案。結(jié)果表明，給藥期間蛋清、蛋黃和全蛋中地克珠利殘留量與給藥時(shí)間成正比，最高殘留量均出現(xiàn)在給藥第12天，蛋黃中地克珠利殘留濃度最高，在蛋清中殘留濃度最低。這可能與藥物在雞蛋中殘留濃度與蛋黃和蛋清的形成時(shí)間密切相關(guān)，蛋白的形成時(shí)間為1～2 d，蛋黃在卵巢中形成時(shí)間為12 d[15]。停藥后蛋清、蛋黃和全蛋中地克珠利殘留前期消除較快、后期消除緩慢，從消除半衰期來看，地克珠利在蛋清中滯留時(shí)間比在蛋黃中長(zhǎng)，消除更慢，這可能與地克珠利與蛋白質(zhì)的結(jié)合的穩(wěn)定性密切相關(guān)，穩(wěn)定性越好，在蛋清中的殘留越長(zhǎng)[16]。

4 結(jié) 論

目前，國內(nèi)外關(guān)于地克珠利在雞蛋中的殘留消除研究很少，隨著抗球蟲藥物的廣泛使用，地克珠利在雞蛋中的殘留情況不容忽視。本研究針對(duì)雞蛋中地克珠利殘留建立了一種簡(jiǎn)單、高效、靈敏的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，并首次研究和探討了地克珠利在蛋清、蛋黃和全蛋中的殘留消除規(guī)律，地克珠利在蛋黃中消除最快，在蛋清中消除最慢。根據(jù)地克珠利在雞蛋中的殘留情況，建議雞蛋中地克珠利的最大殘留限量為240 μg/kg，棄蛋期從給藥第5天至停藥第8天，共16 d，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。