土壤中抗生素多殘留污染現狀及前處理方法研究進展

陳 晨，李秀波，王宏磊，劉義明

(中國農業科學院飼料研究所，國家飼料藥物基準實驗室，北京 100081)

獸用抗生素可以抑制病原微生物的生長，從而治療在養殖過程中畜禽產生的各種疾病，提高動物性食品的產量與質量。據統計我國平均每年約有上千萬噸的獸藥廣泛應用于動物疾病治療、預防和畜禽飼料添加劑等多個方面。但作為環境污染物，這些抗生素會有30%～90%以原形或代謝物形式從糞便中排出體外從而被直接施入農田[1-2]，且殘留時間較長，在土壤中進行殘留積累[3]。土壤中累積的獸藥一方面會破壞土著微生物菌落，誘導產生抗性細菌以及耐藥性細菌，從而使土壤環境中的抗生素抗性基因豐度增加以及產生耐藥性細菌[4-5]。國內外研究表明，即使是污染較輕的地區也同樣檢測出含有氟喹諾酮類藥物等大量抗性基因[6-7]。另一方面，抗生素還會聯合土壤中的其他離子，影響土壤中生物群落的多樣性以及生物學的功能。形如磺胺甲惡唑與銅離子同時在土壤中存在的情況下會顯著降低土壤中總磷脂脂肪酸、細菌磷脂脂肪酸和真菌磷脂脂肪酸的含量[8]。另外土壤中的抗生素還可以通過食物鏈產生生物富集，對人類的健康帶來嚴重的危害[9]。因此,研究者對獸藥在環境土壤中的檢測技術越來越重視，針對復雜的土壤基質開發出了不同的前處理技術。本文概述了國內外重點地區的環境土壤中獸藥污染現狀，同時系統總結了近年來土壤樣品中獸藥靶向與非靶向篩查方法的樣品前處理技術，并對相關技術進行了比較和展望，以期望促進獸藥檢測方法的開發以及環境土壤中獸藥含量的檢測。

1 土壤中獸用抗生素的來源

獸用抗生素在所有的抗生素使用中占有很大的比重。據統計，全球約有70%的抗生素使用在畜牧養殖行業，每年有超過9.7萬噸的抗生素投入畜禽養殖業中[10-11]。大量獸用抗生素的使用成為環境土壤中抗生素的主要來源。環境土壤中獸藥的輸入途徑主要有兩種：一是有機肥在土壤中直接施肥造成土壤中獸藥抗生素污染；二是使用污染的水資源對農田進行灌溉。其走向流路可以概括為圖1。

圖1 土壤中獸用抗生素的來源流程圖[23-24]Fig 1 Flow chart of antibiotic source[23-24]

1.1 施肥 隨著集約化養殖環境的迅速發展，含有各種抗生素的畜禽糞便量也不斷增加。這些糞便中的抗生素雖然會因為堆肥等處理手段降解一部分[12]，但是單純的堆放處理抗生素降解不顯著[13-14]，在養殖場的糞便中仍然檢測出大量的抗生素，特別是四環素類與喹諾酮類。其中環丙沙星、強力霉素和土霉素的最高含量超過1000 μg/kg[15]。這種被污染的糞便直接施用于土壤或者是經過處理制成有機肥施用于土壤都會造成土壤中獸藥抗生素的殘留，經過累計以及生物鏈的富集，從而流向人體，對人類以及整個生態系統產生威脅。有研究表明相對于不使用豬糞的土壤，長期使用豬糞的稻田表層土壤中四環素含量具有明顯的累積現象，濃度范圍為：ND～344.74 μg/kg，且長期使用豬糞會造成稻田表面的抗性基因的豐度顯著升高[16]。

1.2 灌溉 獸藥抗生素在水產養殖中也廣泛使用[17]。我國很多淡水養殖地區的養殖水體中已經有一定量的磺胺類和喹諾酮類抗生素的殘留，并可能威脅到水生生物的安全[18-19]。其被污染過的水質直接流入水體或沉降富集于底泥中造成環境水的污染[20]，被污染的環境水資源在對農田等進行灌溉的時候就會造成土壤中不同程度的獸藥抗生素累積[21-22]。

2 土壤中獸用抗生素的污染狀況

在我國的各個區域內的土壤中都不同程度的檢出了獸藥抗生素殘留。其中包括畜禽養殖場周邊土壤、蔬菜基地和城市土壤等。有研究指出城市土壤中的抗生素濃度高于農業土壤[25]。檢出量最多的抗生素有四環素類、喹諾酮類和磺胺類，有的甚至已經超出了獸藥國際協調委員會(VICH)籌劃指導委員會提出的土壤抗生素毒害效應的觸法值(100 μg/kg)，具有一定的生態風險。但是各個地方土壤中的抗生素檢出濃度具有較大的差異，發生重大差異的原因可能是因為每個地方的施肥與灌溉的習慣不同。有文獻指出環境土壤中獸藥抗生素殘留的含量與土壤采集的深度、使用不同動物糞便施肥都有很大的關系[26]。Gu等指出徐州市畜禽養殖場土壤中氟喹諾酮類抗生素和大環內酯類化合物的總濃度遠高于磺酰胺類[27]。氟喹諾酮類與大環內酯類抗生素在土壤中降解較慢，吸附性較長，能在土壤中穩定的存在。四環素類抗生素由于其廣譜性與價格低廉所以廣泛應用畜牧養殖業中，但是這些抗生素不能完全被機體吸收，而大部分以原形或者代謝產物的形式從體內排出，并隨著農用最終在土壤中進行吸附積累，進而危害農業生態安全。農業土壤中四環素類抗生素已經成為當前農業環境污染及生態安全研究的熱點之一。具體的檢出情況如表1所示。

表1 抗生素在環境土壤中的殘留濃度Tab 1 Residual concentration of antibiotics in Environmental Soil

3 土壤中獸用抗生素的檢測前處理技術

獸用抗生素殘留的檢測方法主要有免疫分析法與儀器分析法，但是在檢測之前樣品的制備一直作為整個藥物殘留檢測的關鍵環節，因為檢測獸藥殘留的基質成分比較復雜，基質效應影響比較嚴重，另外藥物以及其代謝產物各種物理化學性質不同，在不同的酸堿濃度下顯示不同的電離特性[39]，從而對前處理的條件要求比較嚴苛。由于干擾獸藥多殘留分析的原因比較多，且在建立以及優化獸藥殘留預處理方法的時候，必須考慮減少使用有機化學溶劑，從而減少對環境的污染，除此以外，良好的預處理方法要盡可能減少其消耗的時間、精力、以及成本，提高被檢測目標的回收率。所以很多年來，藥物多殘留分析中樣品預處理方法一直是檢測的瓶頸之一。近些年來，因為人們對獸藥殘留含量的關注度較多，對殘留獸藥的認識更加深刻，所以針對獸藥殘留建立了大量的預處理方法。傳統的預處理技術有：固相萃取法、QuEChERS、加速溶劑萃取法、液-液萃取法、索氏提取法、超聲波提取法等。土壤基質比較復雜，其中1%～10%動植物腐爛而形成的土壤腐殖質，還有巖石風格所形成的礦物質。近十年來開發的方法中使用的提取液大多數都選擇了EDTA-檸檬酸緩沖液，其在檢測不同土質的時候也僅僅只是優化了檸檬酸鹽緩沖液與有機溶劑。選擇EDTA-Mcllvaine緩沖液提取土壤中抗生素及其降解產物，其原因也是因為避免獸藥抗生素與金屬離子發生螯合作用，從而增加獸藥的提取效果。由于土壤基質中的干擾物較為復雜,往往會與待測的喹諾酮類抗生素在霧滴表面離子化過程中產生競爭,進而影響電噴霧接口處的離子化效率,即產生基質效應。因此，為盡量避免基質效應降低測定方法的準確度，樣品的前處理條件優化至關重要。

3.1 固相萃取技術 固相萃取技術(solid-phase extraction，SPE)是一項常用的對目標物質進行分離、濃縮、凈化和介質交換的同時具有多功能的樣品預處理技術，廣泛用于衛生，環境，制藥，臨床，食品和工業化學等領域，目前是土壤中獸藥抗生素多殘留檢測最常用的前處理凈化方法。大多數研究都使用超聲震蕩提取與該技術連用，隨后通過SAX與HLB小柱串聯的前處理方法[40-41]。郭欣妍等利用磷酸鹽緩沖液：乙腈=1∶1超聲萃取，SAX-HLB串聯固相萃取柱凈化與富集，檢測土壤中喹諾酮類、磺胺類、四環素類、大環內酯類和內酰胺類5類25種抗生素，回收率為51.3%～86.4%。并且串聯SAX強陰離子交換柱后，土壤樣品的基質效應降低為75%～160%之間[40]。SUN利用加速溶劑提取與SAX-HLB串聯固相萃取連用技術對土壤中的四環素類、大環內酯類與磺胺類抗生素進行提取。多種技術連用大大減少了土壤基質效應，回收率均在67.3%～97.4%之間[42]。曹勝男等使用甲醇：EDTA=1∶1溶液提取，超聲提取與SPE凈化，對施糞土壤中四環素類、喹諾酮類、磺胺類和大環內酯類4類15種獸藥抗生素進行提取，四環素類的加標回收率為73.2%～97.4%，磺胺類為71.7%～108.4%，喹諾酮類為78.1%～112.8%，大環內酯類回收率為81.2%～98.6%[43]。SPE技術在檢測土壤中獸藥抗生素多殘留的應用見表2。

表2 固相萃取技術在環境土壤中多類獸藥殘留同時分析中的應用Tab 2 SPE technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

續表

3.2 QuEChERS技術 QuEChERS是Anastassiades等[44]在2003年開發的一種消耗時間少，花費少的一種新型的前處理技術。起初應用于蔬菜中農藥的多殘留檢測，后來因為操作方便，被引用到獸藥殘留等各個領域中。QuEChERs前處理技術可以利用吸附填料與基質中的雜質相互吸引，從而有效地去除檢測物中的有機酸、糖類、多環芳烴等成分，使被檢測物質回收率良好，該方法在基質比較復雜的土壤獸藥抗生素的檢測中更實用。QuEChERS技術與SPE技術相似，先使用提取液進行提取，而后進行濃縮，與SPE技術的不同之處在于它選用的是合適的具有吸附作用的QuEChERS鹽包作為吸附劑，例如C18粉[45]，石墨烯、碳納米材料等，對藥物或者雜質進行吸附，使被檢測物回收率提高的同時減少基質效應所產生的影響。有研究表明，相比于固相萃取技術，QuEChERs更加方便，同時回收率更好[46]。使用QuEChERs檢測土壤中磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類、四環素類、林可胺類，其在添加范圍內線性關系良好，而且回收率都可以達到61%～118%[46-49]。在進行土壤中獸藥抗生素等多殘留分析時，除了環丙沙星、馬波沙星等氟喹諾酮類、莫能菌素回收率很低以外，其他抗生素使用QuEChERS提取的結果均優于加壓萃取技術。且相比于加壓萃取技術，QuEChERS更適合分析大環內酯類阿奇霉素和替米考星、硝基咪唑類、四環素類和鏈霉素維吉尼亞霉素[50]。QuEChERS技術在檢測土壤中獸藥抗生素多殘留的應用見表3。

表3 QuEChERS技術在環境土壤中多類獸藥殘留同時分析中的應用Tab 3 QuEChERS technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

QuEChERs凈化技術在檢測其他基質的獸藥多殘留方面已有應用報道，但目前在土壤基質中同時檢測多類藥殘留方面的研究不多。但其操作簡單，回收率好，重復程度好，其在未來將很好的應用于土壤中獸藥抗生素的檢測。

3.3 液-液萃取技術 液-液萃取技術(liquid-liquid extraction，LLE)主要通過目標待測物質在不同的兩種液體中的溶解度不同而提取，其具有提取和凈化兩種作用。陳海燕等利用0.1 mol/L氫氧化鈉：甲醇=5∶5提取，二氯甲烷萃取，經過高效液相色譜-熒光檢測器檢測土壤中三種磺胺類的獸藥抗生素，回收率為74.17%～104.35%，同時檢測線可以達到2.5 μg/kg[51]。另外還有SUN[52]使用LLE技術檢測土壤中的喹諾酮類抗生素，其回收率也都大于90%，且批內與批間變異均不超過5%。但是相對于其他的前處理方法，液-液萃取技術在進行土壤中獸藥抗生素多殘留檢測時，一般僅僅適用于同一類的獸藥抗生素，目前針對土壤中多類多種獸藥抗生素的檢測使用液-液萃取技術的鮮有人研究。況且液-液萃取需要較多的有機試劑，這對環境會造成更進一步的破壞。

3.4 加速溶劑萃取技術 加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)又稱加壓液相萃取(PLE)，其全自動程度很高，可以連續的進行提取過濾。在高溫高壓的條件下，提高目標獸藥抗生素在提取劑中的溶解度，從而提高前處理的回收率。孫寶利等建立了一種ASE-HPLC-MS/MS檢測方法用于測定土壤中四環素類抗生素殘留含量，回收率均在60.1%～103.8%之間，相對標準偏差在2.6%～4.8%之間[53]。楊靜等聯合加速溶劑萃取與固相萃取技術，檢測土壤中的6種喹諾酮類的抗生素，將基質效應因子控制在0.84～1.04之間，且回收率在60.9%～89.9%，很好的減少了土壤基質對質譜檢測器產生干擾問題[54]。Marie-Virginie Salvia[55]利用甲醇∶乙腈∶0.2M檸檬酸(pH=4.5)=40∶40∶20(V/V/V)提取液，經過快速溶劑萃取，利用LC-MS/MS檢測土壤中喹諾酮類和四環素類抗生素，回收率喹諾酮類>87%，但是四環素類回收率在在25.4%～41.7%之間。所以快速溶劑萃取技術比較適用于檢測土壤中同一類的獸藥抗生素。但是同時檢測多類的抗生素時，效果不是很理想。

4 展 望

環境土壤中的抗生素殘留檢測技術還處于正在發展的階段，面臨著一系列的問題。常用的檢測手段有理化檢測手段分析與免疫檢測。在市面上常見的快檢方法ELISA、膠體金等使用針對一種靶標物的檢測，不能滿足對多獸藥殘留的高通量多元分析要求。色譜-質譜聯用方法雖然靈敏度高，但是實驗室條件要求比較高，操作復雜，費時費力，成本比較高，盡管在多殘留檢測手段中出現了定量檢測的生物芯片技術，達到樣品前處理的集成化以及操作靈敏度與特異性來說相對較好，但是液質聯用仍然是現階段最常用的技術。本文針對近十年土壤中抗生素的檢測方法相互比較，從前處理的提取液、前處理技術等多方面進行闡述。土壤中獸藥抗生素的檢測現狀：一是開發優化的方法比較單一，大多數開發方法還集中于提取液以及萃取技術的優化；二是現在大多數的環境中獸藥抗生素的檢測方法還都處于靶向的檢測，針對非靶向檢測技術還不成熟，因為土壤中的獸藥種類復雜，含量較多。所以非靶向的檢測技術的發展有利于環境中土壤中的抗生素含量的檢測，非靶向的檢測技術的發展就需要非靶向的譜圖庫的建立。

綜上所述，高分辨質譜是環境土壤中抗生素檢測的強有力的工具，但是在該檢測技術下還需要更多的研究：①高分辨質譜分析技術在環境水樣品中已經開始逐漸發展，但是在土壤中的環境檢測還鮮有報道，所以使用高分辨質譜對土壤樣品的前處理凈化過程還需要進一步發展探索，同時在前處理過程中考慮多種提取凈化步驟連用是將來的發展趨勢；②高分辨的非靶向技術在環境中已經開始發展起來，國內已經發布了關于高分辨質譜檢測水環境中獸藥的國家標準[69]，但是在土壤中的關注度還是比較低，所以高分辨質譜的檢測技術相關標準制定，或者是非靶向的抗生素篩查將是未來發展的方向。