酒五味子的指紋圖譜建立及化學模式識別分析

李慧峰 田凡玉 孟霜 孔祥鵬 王兵 裴妙榮

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）24-3008-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.11

摘 要 目的：建立酒五味子的指紋圖譜，并進行聚類分析和主成分分析。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。以Diamonsil C18（2）為色譜柱，以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為250 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。以五味子醇甲為參照峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》繪制15批酒五味子飲片樣品的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，確定共有峰。采用SPSS 22.0軟件進行聚類分析、主成分分析。結(jié)果：15批酒五味子飲片樣品共有20個共有峰，相似度為0.983～0.999;共指認出其中8個共有峰，分別為5-羥甲基糠醛、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素。聚類分析結(jié)果顯示，15批酒五味子飲片可聚為4類，其中S1～S4、S14聚為一類，S9～S11聚為一類，S5、S7～S8、S12～S13聚為一類，S6、S15聚為一類。主成分分析結(jié)果顯示，前4個主成分的累計方差貢獻率為85.381%，分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。與生五味子比較，酒制后的五味子中新增了5-羥甲基糠醛，且含量較高，而其余色譜峰未見明顯差異。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜簡便、易行，結(jié)合聚類分析和主成分分析可用于酒五味子飲片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 酒五味子;高效液相色譜法;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析

Establishment of HPLC Fingerprint of Wine-processed Schisandra chinensis and Analysis of Chemical Pattern Recognition

LI Huifeng1，TIAN Fanyu1，MENG Shuang2，KONG Xiangpeng1，WANG Bing1，PEI Miaorong1（1. College of Chinese Medicine and Food Engineering， Shanxi University of Chinese Medicine/Shanxi Modern Chinese Medicine Engineering Laboratory， Shanxi Jinzhong 030619， China; 2. Central Laboratory， Shanxi Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine， Taiyuan 030013， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint of wine-processed Schisandra chinensis， and to conduct cluster analysis and principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 （2） column with mobile phased consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm， and the column temperature was 30 ℃; the injection volume was 10 μL. With schisandrol A as the reference peak， HPLC fingerprints of 15 batches of samples were drawn and their similarity were evaluated with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）. The common peaks were determined. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 22.0 statistical software. RESULTS： There were 20 common peaks in 15 batches of samples， and the similarities were 0.983-0.999; a total of 8 common peaks were identified， namely 5-hydroxymethyl furfural， schisandrol A， schisandrol B， schisantherin A， schisantherin B， deoxyschizandrin， γ-schizandrin， pseudo-γ-schizandrin. The results of cluster analysis showed that 15 batches of wine-processed S. chinensis could be clustered into 4 categories. Among them， S1-S4 and S14 were clustered into one category， S9-S11 were clustered into one category， S5， S7-S8， S12-S13 were clustered into one category， and S6 and S15 were clustered into one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of first four principal components was 85.381%; the classification results were basically consistent with the results of cluster analysis. Compared with S. chinensis， 5-hydroxymethyl furfural was newly found in S. chinensis after wine-processing， with high content; but there was no significant difference in the other chromatographic peaks. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint is simple and easy to operate， combined with cluster analysis and principal component analysis， can be used for quality control of wine-processed S. chinensis decoction pieces.

KEYWORDS? ?Wine-processed Schisandra chinensis; HPLC; Fingerprint; Cluster analysis;? Principal component analysis

基金項目：山西省重點研發(fā)計劃重點項目（No.201603D31140-10）;山西省實驗動物專項資金項目（No.2015K06）;山西省中藥材、中藥飲片地方標準研究項目（No.2014004B）

講師，碩士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)及質(zhì)量控制。電話：0351-3179979。E-mail：lihuifeng2046@163.com

通信作者：教授，碩士。研究方向：中藥復方化學及新產(chǎn)品開發(fā)。電話：0351-3179979。E-mail：peimr602@163.com

酒五味子為五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.經(jīng)黃酒蒸制而成的炮制加工品，最早記載于宋代《圣濟總錄》，曰“用酒三升浸三日取出焙干”[1]。五味子酒制旨在借酒行藥勢，增強其滋腎功效[2-3]。有研究指出，五味子主要含有木脂素類、三萜類、有機酸類、多糖類及揮發(fā)油等成分，其中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯甲等木脂素類化合物為其主要活性成分[4]，具有改善心肌缺血/再灌注引起的心肌損傷、心肌肥大、心肌氧化損傷和保肝護肝、調(diào)節(jié)中樞、增強免疫、改善腎功能、抗菌抑菌等作用[5]。目前，關(guān)于生五味子的指紋圖譜研究較多[6-7]，也有通過建立指紋圖譜區(qū)分南、北五味子并比較兩者化學成分的研究[8];而關(guān)于酒五味子的研究則主要集中在補腎功效評價、酒制前后木脂素類成分含量變化等方面[9-11]。酒五味子飲片在臨床及成方制劑中多有應(yīng)用，如2020年版《中國藥典》（一部）收載的人參養(yǎng)榮丸、健腦丸等[12]。酒五味子飲片雖被收載于《山東省中藥飲片炮制規(guī)范（2012年版）》[13]和《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范（2019年版）》[14]中，但并未有指紋圖譜的規(guī)定。因此，基于指紋圖譜的質(zhì)量控制研究有限，使得酒五味子飲片的整體質(zhì)量無法得到全面評價，五味子酒制前后的成分差異未能被完全闡明，制約了酒五味子炮制機制及藥效作用的深入研究。

中藥指紋圖譜具有重現(xiàn)性好、專屬性強、穩(wěn)定性好的特點，可全面系統(tǒng)地表征中藥化學成分的特征[15]。化學模式識別分析能鑒別藥材樣品之間的差異，綜合評估中藥的質(zhì)量[16-17]。基于此，本研究建立了酒五味子的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析等對其質(zhì)量進行評價，旨在為酒五味子的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有2695型HPLC儀及配備的2998型二極管陣列檢測器、Empower 2色譜工作站（美國Waters公司），AB135-S型十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，F(xiàn)A2104型萬分之一電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司），SB-5200 DTDN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

5-羥甲基糠醛對照品（批號111626-202013）、五味子醇甲對照品（批號110857-201815）、五味子酯甲對照品（批號111529-201706）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于95%;五味子酯乙對照品（批號58546- 55-7，純度97.2%）購自上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司;五味子醇乙對照品（批號151113）、五味子甲素對照品（批號131111）、五味子乙素對照品（批號151113）、五味子丙素對照品（批號140617）均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

15批五味子藥材（編號Y1～Y15）均購自河北省某藥材市場、山西省某中藥飲片公司或北京同仁堂藥店，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室裴香萍副教授鑒定均為木蘭科植物五味子S. chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。根據(jù)本課題組前期所得最優(yōu)酒制工藝進行炮制：取凈五味子藥材1 kg，加黃酒200 g，拌勻，悶潤30 min，置于罐或適宜容器內(nèi)，密閉，隔水加熱，蒸約2 h至酒盡，待藥材顏色變黑時，取出，于60 ℃下干燥，即得酒五味子飲片（共15批，編號依次為S1～S15）。15批五味子藥材來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～8 min，5%A→10%A;8～25 min，10%A→60%A;25～55 min，60%A→68%A;55～64 min，68%A→70%A;64～90 min，70%A→80%A;90～93 min，80%A;93～94 min，80%A→5%A）;檢測波長為250 nm;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取酒五味子飲片粉末（過四號篩，下同）約1 g，精密稱定，置于25 mL錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 分別取5-羥甲基糠醛、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素對照品0.98、3.44、0.91、1.24、1.03、0.71、0.93、0.38 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使其完全溶解，冷卻，用甲醇定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖，以五味子醇甲為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.96%（n=6），相對峰面積的RSD為0.95%～2.00%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、3、6、9、12、15 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以五味子醇甲為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.97%（n=6），相對峰面積的RSD為0.59%～1.99%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取酒五味子飲片（編號S1）粉末，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以五味子醇甲為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.56%（n=6），相對峰面積的RSD為0.89%～2.06%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立及對照指紋圖譜的生成 取15批酒五味子飲片粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對所得酒五味子的色譜圖進行分析，以分離度較好的S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法生成疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜。結(jié)果顯示，15批酒五味子飲片共有20個共有峰。酒五味子飲片的HPLC疊加指紋圖譜見圖1，對照指紋圖譜見圖2。

2.1.8 共有峰的指認 取 “2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖3）。將15批酒五味子飲片的HPLC疊加指紋圖譜與上述混合對照品溶液色譜圖進行對比，共指認了其中8個共有峰，分別為5-羥甲基糠醛（峰1）、五味子醇甲（峰2）、五味子醇乙（峰5）、五味子酯甲（峰9）、五味子酯乙（峰10）、五味子甲素（峰13）、五味子乙素（峰18）、五味子丙素（峰20）。由于五味子醇甲（峰2）的峰面積較大、出峰時間居中、峰形好，且與相鄰色譜峰分離較好，故選擇五味子醇甲為參照峰。

2.1.9 相似度評價 以酒五味子飲片的對照指紋圖譜為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價。結(jié)果顯示，15批酒五味子飲片指紋圖譜的相似度均大于0.98。結(jié)果見表2。

2.2 聚類分析

以15批酒五味子飲片指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，利用SPSS 22.0軟件，運用Ward法以平方Euclidean距離為測度進行聚類分析。結(jié)果顯示，當距離為20時，15批酒五味子飲片可聚為兩類，其中S1～S4、S14聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地均為河北;S5～S13、S15聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地為東北地區(qū)（黑龍江、吉林和遼寧）。當距離為6時，15批酒五味子飲片可聚為3類，其中S1～S4、S14聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地均為河北;S5、S7～13聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地為黑龍江和吉林;S6、S15聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地均為遼寧。當距離為4時，可進一步將S5、S7～13分為兩類，其中S9～S11聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地為黑龍江;S5、S7～S8、S12～S13聚為一類，其藥材生品的產(chǎn)地均為吉林。以上結(jié)果提示，不同產(chǎn)地酒五味子飲片的化學成分存在差異。結(jié)果見圖4。

2.3 主成分分析

利用SPSS 22.0軟件，將15批酒五味子飲片指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積進行標準化處理，再通過主成分法進行因子分析。總方差解釋結(jié)果顯示，共有4個主成分的特征值大于1，方差貢獻率分別為47.031%、15.546%、13.743%、9.061%，累計方差貢獻率為85.381%。結(jié)果見表3。

以15批酒五味子飲片指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，利用SPSS 22.0軟件繪制碎石圖，詳見圖5。由圖5可知，前4個主成分之間的坡度較陡，其余主成分之間的坡度較緩，表明這20個主成分中，前4個主成分具有主導作用。

以15批酒五味子飲片指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積為變量，利用SPSS 22.0軟件進行成分矩陣分析，詳見表4。由表4可知，第1主成分主要反映峰1～3、5～6、8、10、12～17、19對應(yīng)成分的信息，其中峰1為5-羥甲基糠醛、峰2為五味子醇甲、峰5為五味子醇乙、峰10為五味子酯乙、峰13為五味子甲素，其余峰未知;第2主成分主要反映峰7、9、11對應(yīng)成分的信息，其中峰9為五味子酯甲，其余峰未知;第3主成分主要反映峰18、20對應(yīng)成分的信息，其中峰18為五味子乙素、峰20為五味子丙素;第4主成分主要反映峰4對應(yīng)成分的信息，該峰未知。這表明通過因子分析降維處理后所提取的4個主成分能代表酒五味子飲片指紋圖譜中20個共有峰的主要信息（因第4主成分反映的峰信息未知且數(shù)量少，故僅對前3個主成分進行后續(xù)散點圖分析）。

由表3中的特征值和表4中的成分矩陣結(jié)果計算主成分載荷矩陣（U）：Ui=Ai/[√λi] （式中，λ為特征值，A為成分矩陣，i=1～3）。將酒五味子飲片指紋圖譜中20個共有峰的相對峰面積進行標準化處理得到X1～X20，根據(jù)U1、U2、U3和X1～X20計算主成分得分（Y）：Y1=U1（1）X1+U1（2）X2+……+ U1（20）X20;Y2=U2（1）X1+U2（2）X2+……+U2（20）X20;Y3=U3（1）X1+ U3（2）X2+……+U3（20）X20。以第1、第2、第3主成分的因子得分（Y1、Y2、Y3）為變量，利用SPSS 22.0軟件繪制15批酒五味子飲片的散點圖（空間中距離較近的為同類樣本[18]），詳見圖6。由圖6可知，S1～S4、S14為一類，S5～S13、S15為一類;按照其在空間中的分散程度分析可知，S9～S11為一小類，S5、S7～S8、S12～S13為一小類，S6、S15為一小類，但S6和S15在空間中相對分散，可能是由飲片生產(chǎn)企業(yè)工藝不同或藥材采收時間差異所致。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本相同。

2.4 五味子酒制前后的HPLC圖對比

精密稱取生五味子（編號Y1）及酒五味子飲片（編號S1）粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，與生五味子比較，酒制后的五味子中新增了5-羥甲基糠醛，且含量較高，而其余色譜峰未見明顯差異。結(jié)果見圖7。

3 討論

本課題組前期在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行了全波長掃描，并分別比較了283、250、210 nm波長下指紋圖譜中各色譜峰的出峰情況。結(jié)果顯示，于283 nm波長下，5-羥甲基糠醛色譜峰的響應(yīng)最強，其余色譜峰的響應(yīng)較弱;于210 nm波長下，色譜圖的基線噪音較大;于250 nm波長下，所得指紋圖譜的色譜信息較全面，基線較平穩(wěn)，故選擇250 nm為檢測波長。同時，本課題組前期分別對不同色譜柱[Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Brava BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱時，酒五味子中各色譜峰分離良好，而采用另外兩種色譜柱時，峰3～7未達到完全分離，分離效果欠佳，故選擇Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱。

15批酒五味子飲片指紋圖譜的相似度均大于0.98，表明不同批次酒五味子飲片之間成分差異較小，相似性良好。聚類分析結(jié)果顯示，當距離為4時，15批酒五味子飲片樣品可聚為4類，其中河北產(chǎn)樣品S1～S4、S14聚為一類，黑龍江產(chǎn)樣品S9～S11聚為一類，吉林產(chǎn)樣品S5、S7～S8、S12～S13聚為一類，遼寧產(chǎn)樣品S6、S15聚為一類，表明聚類分析可以區(qū)分不同產(chǎn)地的酒五味子樣品。主成分分析結(jié)果顯示，前4個主成分的累計方差貢獻率為85.381%;15批酒五味子飲片分為4類，與聚類分析結(jié)果基本相同。本研究采用中藥指紋圖譜相似度評價和聚類分析、主成分分析等化學模式識別分析對15批酒五味子飲片的質(zhì)量進行了評價，所得結(jié)果基本一致，可為酒五味子飲片的質(zhì)量控制提供參考。

有研究發(fā)現(xiàn)，生五味子在炮制、煎煮或長時間放置過程中，其所含葡萄糖等單糖化合物在高溫環(huán)境下可轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛[19]。5-羥甲基糠醛是一種具有毒性的活性成分：一方面，其具有抗氧化、改善學習記憶、抗心肌缺血的作用;另一方面，該成分又具有神經(jīng)毒性，可致橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害[20-21]。本研究結(jié)果顯示，生五味子中不含5-羥甲基糠醛;而經(jīng)酒制后，酒五味子中的5-羥甲基糠醛（峰1）含量顯著增加，而其余色譜峰未見明顯差異。因此，筆者認為，5-羥甲基糠醛含量可作為酒五味子飲片炮制工藝以及質(zhì)量控制的關(guān)鍵參數(shù)。《本草綱目》記載，五味子“入補藥熟用”[22]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酒五味子補腎作用最好[9-10]，但5-羥甲基糠醛是否為酒五味子補腎作用的有效成分，且該成分是否會影響酒五味子應(yīng)用的安全性，尚待后續(xù)研究進一步探討。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜簡便、易行，結(jié)合聚類分析和主成分分析可用于酒五味子飲片的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2021-07-12 修回日期：2021-11-05）