廣州管圓線蟲現代檢驗技術研究進展

王乾宇

(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558013)

廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)是主要分布在亞太地區的一種蠕蟲類寄生蟲，最早由我國學者陳心陶教授在上世紀30年代發現并命名為廣州肺線蟲(Pulmonema cantonensis)[1]，后幾經周折，于1946年更名廣州管圓線蟲[2]。在分類上，廣州管圓線蟲屬于后圓線蟲超家族、管圓線蟲家族，其終末宿主為嚙齒類尤其是家鼠和褐家鼠，中間宿主為軟體類動物如福壽螺、褐云瑪瑙螺、蝸牛和蛞蝓等，而淡水魚(蝦、蟹)、蛙、蛇等為轉續宿主，人類是其非適宜宿主。一般認為廣州管圓線蟲是人體嗜酸粒細胞增多性腦脊膜炎或腦膜腦炎(EM或EME)的重要病原體。人類通過生食或半生食以上螺類、醉蝦、醉蟹、蛙類、蛇膽、蛇肉或被具有傳染性的Ⅲ期幼蟲污染的蔬菜等食物后被感染。一旦感染廣州管圓線蟲其可在人體器官中移行、發育成Ⅳ期、Ⅴ期幼蟲并寄生在人體不同部位，蠕蟲在大腦中移動帶來的損傷以及人體對死亡蟲體的強烈免疫反應引發嗜酸性粒細胞增高性腦膜炎、腦膜腦炎、嗜酸性粒細胞性脊神經根腦膜炎、腦脊神經根炎等病癥，有的甚至在眼部發現其成蟲。因侵襲部位不同，患者會出現多種癥狀而造成診斷困難：輕微的感染可能導致頭痛、頸部和肩部疼痛、皮膚敏感和刺痛、視覺障礙、各種其他癥狀，有時還有一些發燒，所有這些癥狀都可能自動消失，甚至患者自身都未意識到他們已經被感染。但是感染嚴重時這些癥狀可能更加嚴重，并可能出現其他的癥狀，如運動障礙和消化和尿路功能障礙，甚至昏迷或死亡[3]。

在溫暖的地區或季節，容易爆發廣州管圓線蟲疫情，近二、三十年以來，在我國廣東、廣西、云南、湖南、福建等地都有疫情記錄[4]。近期的監測數據顯示，在廣動江門螺類總陽性率為5.78%，福壽螺陽性率達13.89%[5]。貴州南部、東南部地區居民有食涼拌螺、生魚、腌漬魚的傳統，而福壽螺等驚人的繁殖能力使其蟲卵在田埂上隨處可見，在貴州市售的食用螺中檢出廣州管圓線蟲感染率：福壽螺為0.4%；褐云瑪瑙螺感染率為11.3%[6]，加之稻田魚養殖等方興未艾，諸多因素使得本地居民爆發感染廣州管圓線蟲的風險日益增加。為保護人民健康，國家對廣州管圓線蟲病高度重視并投入科技力量研究該病的防治。

病原蟲的檢出是人類廣州管圓線蟲檢測的金標準，但因蟲體數量少、密度低以及移行等原因，廣州管圓線蟲檢出率在患者腦脊液、眼等部位檢出率極低，目前僅為2%～12%[7]，傳統的糞檢等也無法檢出，不能滿足臨床病原學診斷需要。免疫學檢測是常用的方法[8]，主要有：(1)間接熒光抗體試驗(IFAT)，用成蟲或Ⅲ期幼蟲制作冷凍切片作為抗原，可以檢出大鼠或人抗血清中的抗體；(2)免疫酶染色試驗(IEST)，此法結合了免疫反應的高特異性和酶促反應的高效性，簡便易行，判斷結果時無需特殊儀器設備，適合現場應用，可考慮作為輔助診斷方法；(3)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，因對血清具有較高的敏感性和特異性得到較廣地應用，雖對旋毛蟲抗體陽性血清、犬弓蛔蟲抗體陽性血清時分別有20%和10%的假陽性，但對特定人群，如疫區人群進行流行病學調查時，ELISA仍不失為一類有效的檢測方法[8]。要注意的是以上這些免疫學檢測方法涉及的抗原抗原種粗抗原、純化抗原等等，而抗原的提純也是方法各異、標準各異，沒有統一的標準。另外臨床上有少數病例未出現發熱、嗜酸性粒細胞增多等典型指征，容易被誤診[9-10]。綜上，研發特異、靈敏、簡便的檢測方法具有重要意義。以下主要綜述了近10年來廣州管圓線蟲檢測方法的研究進展。

1 PCR及衍生技術

1.1 常用PCR技術 PCR技術是近年來飛速發展的分子生物學檢測技術，歐陽頤[11]對2017年以前的廣州管圓線蟲分子生物學研究進行了階段性回顧：用于檢測的PCR方法主要有PCR、反轉錄PCR(RT-PCR)和實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)等，主要擴增遺傳標記為核糖體DNA內轉錄間隔2區(ITS2)、小亞基核糖體 RNA(SSU rRNA)、細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)及核糖體18S rRNA基因等。18S rRNA基因保守度較高，來自世界各地的樣本相似度高達99%，但對以上目的基因或基因片段的遺傳距離分析顯示來自全球不同地區的原蟲分離株具有遺傳多態性，可以作為分子水平的檢測方法，但是世界各地的PCR檢測方法不一，可比性不強，最好有統一的PCR控制程序及質量控制標準[12]。另外PCR檢測需要特定的儀器、耗時較長，對于野外監測有難度。

1.2 環介導等溫擴增技術(LAMP) 與傳統PCR方法相比，環介導等溫擴增技術(LAMP)具有實驗條件簡單、易操作、篩選更精細的特點：DNA擴增在等溫水浴加熱時即可進行、不需要可變溫的PCR程序和特殊儀器、結果直接在反應管中即可觀察，一些改進的LAMP對于單核苷多態性(SNP)或基因突變都有很好的檢出能力，應用于多個領域，也更適合野外監測。LAMP開始應用于檢測螺內感染廣州管圓線蟲，且檢出率遠高于形態學檢測法。LAMP方法使用的酶是Bst DNA聚合酶，在等溫條件下用它合成一條新的DNA鏈，同時置換互補鏈從而形成莖環結構，擴增莖環可積累肉眼可見的產物。LAMP反應需要四種引物：FIP、BIP、F3和B3。F3和B3有助于形成莖環結構，FIP、BIP與莖環內結構互補用于放大目標序列[13]。但這個方法需設計多對引物，假陽性問題難以避免[14]。

1.3 重組酶介導的等溫擴增技術(RAA) 重組酶介導的等溫擴增技術(RAA)屬于等溫擴增技術的一種，是近年來快速發展的病原體鑒定分子工具，可在恒溫條件下實現核酸擴增、短時間內完成檢測，比之常用的PCR法、LAMP法，該方法具有操作方便快速、引物設計簡單、經濟合算的優勢，已有多個成功應用于寄生蟲檢測的案例報道[15-16]。張強等[17]用生物信息軟件篩選出廣州管圓線蟲內轉錄間隔區1(ITS1)最保守的一段序列(長度為174 bp)作為目標檢測序列，設計、合成出特異性最強的上下、游引物和探針，構建了反應體積為50 μl的熒光RAA反應體系，可在37 ℃、5～10 min內完成擴增反應，檢測靈敏度可達100 pg/μl，而常見的寄生蟲如曼氏血吸蟲成蟲、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲成蟲、以及藁桿雙臍螺、小管福壽螺螺體組織基因組均呈陰性，說明該法的特異性較好，是較好的監測方法。

2 免疫學檢驗方法

在以往的免疫學檢驗方法中，抗原的獲取具有一定的經驗性和盲目性，另外需要考慮主要的治病階段以及蟲體的不同性別。隨著組學技術、分子生物學技術的發展，一些酶或肽段的發現，使免疫學檢驗方法的目的性和精準性大大提高。

用蛋白質組學技術篩選出特異性和靈敏度高的通用抗原，對于原蟲的檢測、免疫診斷和免疫調節都具有重要意義。凝集素(lectins)是具有特異性糖識別位點的可溶性糖蛋白，可以通過多種途徑影響生物體的免疫過程，因此針對動物體內的半乳糖凝集素等也開發出特異性較好的免疫學檢測法。黃慧聰等[18]利用蛋白質組學技術：雙向電泳聯合免疫印跡技術分離得到具有免疫原性的可溶性蛋白質，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)鑒定得出兩個廣州管圓線蟲V期雌雄幼蟲的共同抗原-半乳糖凝集素和肌動蛋白，利用生物信息學進一步進行肽段抗原表位預測及免疫印跡驗證，鑒定半乳糖凝集素具抗原功能的肽段序列為P16(192-207)KNGDIALHFNPRFDEK。此結果為廣州管圓線蟲的的診治和免疫學研究提供一個新的切入點。李星潘等[19]用RT-PCR的方法克隆到Ac-gal 1基因并在原核細胞中成功表達出可溶性活性蛋白，此galectin-1蛋白能被全蟲免疫的小鼠血清識別并與小鼠紅細胞發生凝集反應。

蝦紅素金屬蛋白酶(ALMP)在寄生蟲寄生生活中發揮一系列生物學功能，余良等[20]用RACE技術調取到基因并進行了體外原核表達，用 real-time PCR、免疫熒光定位法研究了其在各時期、各部位的表達情況，推測ALMP與感染期幼蟲對宿主的入侵和組織滲透、蛻皮、攝食和消化以及雄蟲的生殖密切相關。

這些研究為進一步探索廣州管圓線蟲的生活史、防治、疫苗開發奠定了堅實基礎。

3 高通量測序技術

隨著測序技術不斷成熟、成本不斷下降，高通量測序技術被廣泛用于疾病篩查、診斷。嬰幼兒感染廣州管圓線蟲后臨床癥狀多不典型，僅依靠臨床表現和臨床常規檢查往往易貽誤診治造成嚴重后果。陳鴻等[21]報道了2例成功用高通量測序診斷廣州管圓線蟲嗜酸性腦膜腦炎(AEM)的案例，提示臨床上對疑診細菌性腦膜炎而治療效果欠佳患兒應考慮廣州管圓線蟲感染可能，結合血與腦脊液中的嗜酸粒細胞指標，及時抽取腦脊液進行病原學高通量基因測序，可盡早明確診斷，調整治療，改善預后。表明高通量測序對于AEM診斷具有臨床價值，也切實可行。

4 納米金標記技術

納米金是指粒徑為1～100 nm的金粒子,由于粒徑的減小使得納米粒子獲得很多界于宏觀與微觀范圍內特性，比如與粒徑大小相關光吸收及散射性能、比表面積大活性高、強抗氧化性、表面等離子共振性等，這些特性均可用于開發特異性、靈敏性較好的檢測方法。納米金技術已經在不少病原生物檢測中得到應用。納米棒(AuNRs)因具有強大的電場強度、吸附性能、光吸收與散射、雙向等離子吸收等性質在眾多金納米顆粒脫穎而出[22]。孔玉方[23]成功制備廣州管圓線蟲幼蟲粗抗原、成蟲粗抗原、排泄分泌粗抗原等多種抗原功能化納米金棒，并考察了不同感染時間、不同感染度及不同濃度的血清抗體的結合情況，根據表面等離子共振吸收峰紅峰移位值篩選出最適條件并與傳統ELISA法進行了比較，認為廣州管圓線蟲粗抗原功能化納米金棒具有制備簡單、成本低、敏感性和特異性較好的優勢，為開發用于感染早期、低感染度的廣州管圓線蟲病調查和檢測奠定了良好基礎。

近年來，廣州管圓線蟲的檢測方法隨著分子生物學、免疫學、PCR衍生技術、納米金生物標記技術以及高通量測序技術的發展與普及得到發展和豐富，在病原蟲的早期篩查、環境監測、生活史、致病機制研究等方面取得了大的進步，為疾病的盡早、盡快、準確檢測、診斷、治療奠定了良好基礎。因為廣州管圓線蟲病為食物攝入引起，建議在腸道微生態菌群改變及免疫應答適應等方面展開研究，為實現更早的發現、診治疾病拓展思路。