奶中風味物質檢測技術研究進展

遲雪露，劉慧敏，葉巧燕，鄭楠，王加啟

（1.中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所農業農村部奶及奶制品質量安全控制重點實驗室，北京100193；2.新疆農業大學 動物科學學院，烏魯木齊830052）

0 引言

食物風味被定義為通過感知食品氣味，滋味的刺激而產生的信號，整合或相互作用后產生的，短時的綜合的生理感覺[1-3]。這種感覺是由復雜的揮發性分子混合物所觸發的，這些組分通常是痕量濃度（ppm或ppb）的。奶及奶制品是營養均衡、健康飲食的重要組成部分，中國奶產品消費量逐年提升，高端乳制品的消費潛力巨大，在保證營養品質的基礎上，消費者對奶產品感官品質的越發關注。奶產品的外包裝、滋氣味及其質地等對消費者的選擇具有決定性的作用。奶的滋氣味組成較為復雜，帶給人的感覺并不是單一組分香氣強度的加和，還需要考慮化合物的濃度、閾值、以及各組分之間的協同或者拮抗作用[4-5]。研究奶的特征風味物質及建立評價體系，對于保證奶產品感官品質和改善消費體驗，具有十分重要的意義。通過對風味物質檢測及分析方法的總結，以期為多種分析方法聯用，深入探索奶產品感官品質提供參考。

1 奶中風味物質及影響因素

1.1 奶中風味物質

奶中揮發性的風味物質主要為醛、酮、酯、含氮、含硫以及萜烯類化合物等。這些組分與奶的特殊風味密切相關，會賦予其青草氣味、花香味、果香味、焦糖味、黃油味、蒸煮味、中藥味及其他刺激性氣味或異味等。在對奶產品風味進行分析的時候，除了化合物的濃度，還需要關注各組分的氣味閾值，盡管有些化合物在奶中的含量很低，由于其氣味閾值較低，也會對奶的整體香氣產生較大影響。

有研究表明，低濃度的醛含量與草本香氣有關，但在較高濃度下，會產生令人不愉快的異味，并且基于該類化合物較低的氣味閾值，醛類化合物被認為是奶中重要的風味組分[6]。

牛奶中天然存在的飽和脂肪酸的β-氧化、脫羧或β-酮酸脫羧所產生的酮類化合物對奶整體風味也是十分重要的[7-8]。脂肪酸是具有奇數碳原子的甲基酮的前體物質，例如2-戊酮和2-庚酮[9]。低分子量的甲基酮（如丙酮和丁酮）主要來自奶牛的新陳代謝[10]。二乙酰由于其典型的黃油味而引起了關注，二乙酰可以從草料中轉移到牛奶中也可以通過某些奶中化合物的酶促反應形成[11]。

含硫和含氮化合物也是奶中特征性組分，如硫化氫，甲硫醇，二甲基硫醚，二硫化碳，二甲基二硫醚，二甲基三硫醚，二甲基砜，2-乙酰基-1-吡咯啉，苯并噻唑，2-異丁基-3-甲氧基吡嗪，吲哚和糞臭素等[12-14]。吲哚氣味比較特殊，并且閾值低，當其含量很低時特征是帶有茉莉的淡淡香氣，而高濃度吲哚則帶有令人不愉快的糞便味[15]。

萜烯是植物的二次代謝產物，單萜烯和倍半萜烯可以很容易地從草料中轉移到乳脂中，該類化合物通常具有水果味，草味或樹脂味，會在一定程度上影響奶風味，與干草相比，它們在鮮草中的含量更高[16-17]。有研究表明萜烯化合物尤其是半萜烯可以幫助表征從不同牧草，不同季節或不同地理區域飼喂的反芻動物的奶中獲得的奶產品[18-19]。

新鮮牛奶中已鑒定出多種酚類化合物，例如苯酚，鄰甲酚，間甲酚和對甲酚，2-乙基苯酚和4-乙基苯酚，百里酚和香芹酚等[20]。該類化合物被認為主要來自飼料，也可能來源于細菌的氨基酸分解代謝和消毒劑的污染[21]。低含量的酚類化合物會散發出令人愉悅的甜味，輕微煙熏味或焦糖味，但當其含量較高時，會引入刺激性氣味或藥味等異味[22-23]。

1.2 影響奶風味的因素

對奶及奶制品風味產生影響的因素較多，例如奶牛飼喂系統、擠奶過程、奶產品加工工藝、包裝材料以及儲運條件等每個環節都會產生一定影響。

高品質原料奶的生產對于奶制品的加工及銷售至關重要，優質牛奶的生產從牧場開始，因為牛奶的風味和品質在后期加工階段無法提高[24]。原料奶越優質，由此加工制得的奶制品就會越好，因此加強對生乳品質的監測有利于保障優質奶產品的生產。除年齡，健康狀況和泌乳階段等因素外，奶牛品種和其他遺傳特征對牛奶風味也有重要影響[25]。奶牛的喂養系統也會影響牛奶的感官品質，如飼料類型、草料保存方法、草料植物組成以及日糧配方等[26-29]。在擠奶過程中，擠奶設備、擠奶工人、整個農場的衛生條件以及牛奶的收集和存儲都會對其感官品質產生影響[26]。

奶產品的加工工藝對其感官品質影響較大。當熱處理加工變量偏離適當的條件或施加更嚴格的溫度或時間條件時，易出現令人不愉快的味道。和巴氏殺菌乳相比，超高溫滅菌的工藝會產生強烈的硫化氫，甲硫醇，甲基二硫化物，二甲基二硫化物，二甲基三硫化物，二甲基砜等含硫化合物[36]。有研究表明苯并噻唑、δ-內酯和己醛等是典型的熱誘導化合物，可能會賦予產品更濃郁的蒸煮味或卷心菜的味道，從而降低消費者接受度[35-37]。風味是動態變化的，在存儲過程中，揮發性化合物的濃度會逐漸降低，各組分之間會持續發生一系列的化學反應，陳腐味、苦味和蒸煮味會一定程度的增加，使牛奶的整體品質緩慢下降，而精確控制加工條件可以減少這種風味缺陷的發生程度[38-40]。

此外，包裝材料也在很大程度上影響了奶中的風味。Zygoura等將鮮牛奶包裝在透光容器中，然后儲存在有光的陳列柜中時，揮發性化合物2,3-辛二酮的含量顯著增加，奶中會出現典型的蘑菇味和金屬味等光氧化的異味[30]。Vassila等人研究表明某些脂肪酸和氨基酸作為底物，光和核黃素參與光誘導的化學反應，會產生油脂腐敗味、紙板味和金屬味等不良感官描述[31]。除此之外，甲硫醇，二甲基硫醚，二甲基二硫醚，戊醛，己醛，2-丁酮和1-辛烯-3-酮等也被鑒定為光活化組分[32-34]。

2 揮發性組分提取方法

對于揮發性組分的提取方法有很多，頂空固相微萃?。℉eadspace-Solid Phase Micro-Extraction，HSSPM E）、同時蒸餾萃?。⊿imultaneous Distillation Extraction，SDE）和溶劑輔助蒸餾萃取（Solvent Assisted Flavor Evaporation，SAFE）是目前廣泛用于表征牛奶中的香氣組分的前處理技術。不同的前處理方法會直接影響結果的可靠性和準確性，因此需要全面的考慮不同提取手段的優勢及缺點，針對于不同的研究目的，選擇合適的前處理方法。

2.1 頂空固相微萃取

頂空固相微萃取是奶及奶制品風味分析中最為廣泛應用的前處理手段，該方法是一種靜態頂空技術，用于從非揮發性食品基質中快速提取和濃縮揮發物[41-44]。HS-SPME包括兩個不連續的步驟：一是從樣品基質中溶入吸收到熔融石英纖維中，該纖維在外部涂有合適的固定相。二是將分析物轉移到色譜系統中進行分離。該方法可以減少制備時間、溶劑使用和處理成本，在提取低分子量和高揮發性化合物方面更有效，對酯和高揮發性化合物的回收率更高，被廣泛應用于多種食品的風味分析中，如橙汁[42]、大豆[43]、橄欖油等[44]。Vazquez-Landaverde等人使用HS-SPME結合氣相色譜-脈沖火焰光度檢測法對奶中揮發性硫化物進行定性定量分析，研究了生乳高壓處理和熱處理帶來的影響，熱處理傾向于促進甲硫醇、硫化氫、甲基酮及醛類化合物的合成，而高壓處理促進硫化氫和醛類化合物的生成[37]。并通過計算氣味活性值的比較，提出甲硫醇和二甲基三硫化物市UHT牛奶中主要的含硫氣味貢獻物[40]。但是該方法涉及到兩個平衡系統，會對揮發性組分的回收率產生一定程度的影響。

2.2 同時蒸餾萃取

SDE是一種從復雜食品基質中分離揮發物的方法，通過同時加熱樣品液相與有機溶劑至沸騰來實現，蒸餾和提取同時進行，消耗溶劑量較少，香氣成分到濃縮效率高，常用于奶酪、發酵奶或奶粉等產品的風味分析[45]。李寧等人使用SDE結合GC-MS在新疆發酵駱駝奶中鑒定出66種揮發性化合物[46]。

該方法對于中等至高沸點的醛、酮類組分的萃取回收率較高。但是可能會因為操作溫度高，使獲得的香氣組分有失真現象，為提取的香氣帶來“蒸煮味”等氣味，影響后續的風味分析。

2.3 溶劑輔助風味提取

SAFE是一種將蒸餾單元與高真空泵相連接，在高真空和極低溫度條件下，完成揮發物的蒸餾、萃取和冷凝的方法，在此過程中，可以從奶制品[46]，水果[47]，咖啡[48]等新鮮食品中分離出揮發物。該方法對極性高的風味物質有較高的回收率，能得到較為真實可靠的風味提取物。不足之處在于對復雜食品基質中痕量揮發物的提取不充分，需要準備大量樣品，且必須將獲得的有機相（揮發物提取物）在進行氣相色譜-嗅聞分析之前，將其濃縮在韋氏分餾柱（Vigreux）色譜柱中，這會導致高揮發性揮發物的損失。

3 分離鑒定手段

奶風味是由于特定基質中揮發性組分的復雜混合物所構成，多數化合物的濃度非常低，而且牛奶基質的異質性使分離變得困難。隨著色譜柱能效的提高，檢測器靈敏度的精進，使用氣相色譜進行分離是目前最常用的分析方法。但是基于不同的研究需求，氣相色譜與其他分析儀器聯用，已經逐漸成為結構分析中的有力工具，如氣相色譜與質譜聯用、氣相色譜與嗅聞儀聯用、與離子遷移譜聯用等。通過多儀器方法聯用對奶中風味組分進行解析是奶產品感官品質評價的一個重要手段。

3.1 氣相色譜-質譜聯用

常用的揮發性風味物質的定性方法主要有質譜定性、保留指數定性、標準品定性和氣味描述定性，在風味分析上通常認為3種及以上的方法同時定性結果較為準確。質譜定性是利用氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）將樣品中分離的揮發性組分與NIST譜庫進行比對，同時結合人工手動譜圖解析進行定性。定量方法主要是內標法、外標法及面積歸一化法等。賈偉等人使用GCMS、UHPLC/ESI Q-Orbitrap兩種方法，對牛奶、奶制品、香精香料中揮發性組分進行分析鑒定，建立Fisher判別模型，用于預測是否向奶制品中添加調味劑[49]。Sfakianakis和Tzia結合SPME和GC-MS，對比使用超聲均質化和傳統壓力均質化處理牛奶，對制成的酸奶產品進行評價，感官特征差異顯著，超聲處理后某些羧酸、醛和酮類化合物組分濃度增加，一定程度上導致風味變差[50]。Karagul-Yuceer等對Chevre山羊奶酪的風味進行分析，描述型感官評價表明奶味及特征性油脂味/動物味是其特征風味，結合GC-MS和GC-O定性定量分析，結果表明2,3-丁二酮（黃油味）、1-辛烯-3-酮（蘑菇味）、鄰氨基苯乙酮（葡萄味）、內酯（椰子味）、辛酸（刺激性酸味）以及4-甲基辛酸和4-乙基辛酸（油脂味）是山羊奶酪中高強度的風味活性物質，隨后通過香氣重組和缺失分析證明了4-甲基和4-乙基辛酸兩種化合物是特征油脂味/動物味的可能來源[51]。

3.2 氣相色譜-質譜-嗅聞

氣相色譜-質譜-嗅聞（Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Olfactometry，GC-MS-O）是一種結合了氣相色譜-質譜和氣相色譜-嗅聞的技術，將人的鼻子作為檢測分析物的氣味強度儀器，與GC-MS分離鑒定揮發性混合物同時進行，實現了氣味活性化合物檢測的同時獲取其化學結構信息。該技術在食品風味分析中的應用非常廣泛，可以用于表征氣味活性成分，即影響食品氣味特征的代表性化合物[52-54]。

樣品的揮發性提取物通過氣相色譜的毛細管柱分離后，流出物以合適的分流比進入檢測器和嗅聞端口，在質譜定性定量分析的同時，結合試驗員鼻子對揮發性物質的進行主觀檢測，致力于對氣味描述、強度等隨時間的變化情況的研究，針對于一些高氣味強度的揮發性化合物的濃度太低GC-MS無法檢測到的情況，該方法是一種較好的補充[52]。

時間-強度法、強度法、稀釋法及檢測頻率法等常用于鑒定和排序樣品中香氣活性化合物的貢獻。香氣活性值（Odor Activity Value,OAV）是建立在GC-MS精確定量結果的基礎上，結合嗅聞評價的結果，用于表征揮發性香氣組分在特定食品基質中香氣貢獻大小，即香氣組分在樣品中的濃度與香氣組分的香氣閾值的比值，具有較大OAV的香氣組分被認為是對樣品整體風味貢獻更大。OAV值已被廣泛用于確定飲料[53]、白酒[54]、水果[55]，奶酪[51,56]，精油[57]和葡萄酒[58]等食品中重要的芳香活性化合物。

在進行嗅聞評價和OAV計算的過程中，都是對經過色譜柱進行分離、脫離原基質體系后的單個香氣組分的香氣貢獻大小進行獨立計算，這些被鑒定為關鍵香氣組分的化合物，在原樣品基質中共存時，是否會重現樣品的典型香氣特征，需要我們在關鍵成分篩選和香氣貢獻評價的基礎上，進行香氣模擬體系重組，通過評價模擬體系與真實樣品的相似度對關鍵組分進行核實和驗證[51]。通常會使用樣品中定量的香氣活性組分（OAV＞1）制備香氣模型，根據OAV從低到高逐一缺失，以獲得一系列不完整的香氣模型，與原樣品進行感官品質比對評價，進行進一步驗證[51,59]。

田懷香教授使用HS-SPME方法對中國奶扇中揮發性組分進行富集，使用GC-MS和GC-O對其中香氣成分進行分析，鑒定出71種香氣化合物，檢測出31種氣味活性化合物，同時結合對奶扇樣品感官評價、香氣重組和缺省分析的實驗結果，確定了丙酸和2-壬酮（奶酪味），丁酸（陳腐味），辛酸和壬醛（脂肪香氣）和己酸乙酯（果香）為主要香氣化合物[60]。Fuchsmann等人對Tilsit奶酪的氣味特征進行解析，結果表明丁酸、3-甲基丁酸和2,3-丁二酮和黃油氣味密切相關，甲硫醇、二甲基硫、3-甲硫基丙醛主要貢獻了奶酪的氣味[61]。

3.3 氣相色譜-離子遷移色譜

氣相色譜-離子遷移色譜（Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry，GC-IMS）是將氣相色譜高分離能力和離子遷移色譜快速響應的特性結合，使用氣相色譜將待測樣品中的揮發性組分進行初步分離，通過離子遷移色譜進行二次分離的方法。目前該技術已經廣泛應用于藥物檢測、疾病監測、環境保護以及食品風味分析等領域。

該方法可用于檢測不同基質中痕量揮發性有機化合物和半揮發性有機化合物的方法，根據中性緩沖氣體在電場中的遷移率，在常壓下對離子有快速響應和高靈敏度的優勢，并且檢測限低、分析時間短，可常壓工作[62]。雖然IMS在分析方面表現出巨大的潛力，但是在食品風味分析領域，基質交叉的敏感性問題，水分含量等問題會導致樣品在一定程度上被基質化合物所掩蓋，對遷移率、離子濃度以及檢測結果產生一定影響[62-63]，由于GC-IMS沒有類似NIST譜庫的數據庫，這也是限制其應用的原因之一。Janneth等人通過使用GC-IMS對乳酸菌菌株釋放的揮發性化合物進行分離鑒定，并進一步建立指紋圖譜，可以結合主成分分析識別和區分不同的菌株[64]。有學者通過HS-GC-IMS對兩種干燥工藝加工的牦牛奶粉中揮發性化合物進行檢測，共鑒定出17個化合物，包括醛類、酮類、酸類、萜烯類、酯類和雜環類，討論了不同干燥工藝對牦牛奶粉風味的影響[65]。李娟等人采用GC-IMS技術對不同品牌牛奶樣品中揮發性化合物進行分析，共鑒定出29種化合物，結合主成分分析結果，對不同類別或不同品牌奶產品區分效果良好[66]。

4 感官評價

感官科學的發展與應用已經逐漸深入到食品領域，現代化的生產過程中需要監測的產品參數和品質指標越來越多，企業成立專門的品評部門，根據需求通過結合多種感官分析方法（定量描述分析、時間-強度感受分析）、量化方法（線性表度、量值估計）、品評特性（差別型檢驗、描述型分析、偏好性分析）對產品的感官品質進行評價[67,69]。描述性感官分析方法已經廣泛應用于乳制品評估中，以識別和測量最能表征其感官特性的那些屬性[67-68]。感官評價是對視覺，嗅覺，味覺，觸覺和聽覺所感知的刺激反應的量化，主要分為完全主觀的人工感官評價和借助仿生儀器的智能感官分析。

4.1 人工感官評價

定量描述型分析能直觀的看到產品各感官屬性評分，獲得產品感官感受信息量最大、用途最廣泛的方法[69]。在感官描述分析過程中，風味的描述語和感官屬性的評價尺度是主要評價手段。感官評價的試驗員前期需要接受一定的訓練，通過反復對香氣化合物的標準品進行嗅聞評價，使評價員的判斷能力更加穩定準確。在感官評價過程中，以參比樣為標準，通過選擇合適的詞匯進行描述，評價相應的感受強度，得到網狀風味剖面圖，從而較為直觀的發現產品的特征風味及感官缺陷[69]。根據需求選擇性的結合多元統計分析，比較產品間風味差異，可以更有效的分析產品定位與優勢[69-70]。

香氣偏好型分析主要是針對消費者偏好趨向進行研究，面對的是消費者的需求。食品感官品質的評價在一定程度上是基于消費者的主觀評價，與個人情況、時間、地點等因素有關。通過線性表度和描述型分析，結合偏最小二乘回歸和偏好映射等方法對感官評價結果進行分析，是研究消費者對產品感官特征偏好的常見研究方法[69-73]。

國內已經頒布了多項感官分析相關標準，其中大部分都是對國際標準的直接引用[69]。

4.2 智能感官分析

相較于主觀的人工感官評價方法而言，智能感官分析系統作為一種通過儀器模擬人感知器官的研究設想被提出，具有儀器的穩定性和準確性，在一定程度上彌補了感官評價的局限性，被廣泛的應用于食品領域，但是對于綜合屬性的區分不如人工感官評價靈敏、真實[74]。

4.2.1 電子鼻

電子鼻是由性能彼此重疊的多個化學傳感器(即氣體傳感器陣列)和適當模式識別方法所組成的，可以識別簡單和復雜氣味的仿生學儀器,它檢測到的是樣品中揮發性成分的整體信息即“指紋信息”。它不僅可以測定不同的氣味信號，而且還可以將這些信號與經過訓練后建立的數據庫中的信號加以比較，進一步判斷識別分析[74-75]。目前已經商業化的電子鼻有很多種，常見的傳感器類型有金屬氧化物傳感器、導電聚合物傳感器和石英晶體諧振傳感器等，儀器配置的傳感器數量6到40個不等。

王蓓等人通過電子鼻成功區分了三種天然奶味香精和兩種人工合成的奶味香精[73]。Biolatto等人結合SPME-GC和電子鼻對全脂奶粉氣味特征進行檢測，結果表明夏季生產的全脂奶粉中己醛含量較高，秋冬季節二甲基硫醚和正戊醛含量較高，丁酸在秋季和春季之間差異顯著[76]。

4.2.2 電子舌

電子舌與電子鼻相似，是一種對味道綜合信息進行評價的手段，電子舌模仿哺乳動物舌頭對液體味覺信息進行檢測，用類脂膜作為味覺傳感器。傳感器陣列浸入液體試樣中，對液體樣品進行響應，然后信號傳遞給模式識別系統，經初步處理和模式識別，得到反映樣品味道特征的結果[74]。借助于智能感官技術，從傳感器響應曲線上可以看出不同傳感器對樣品的響應情況。通過對樣品進行主成分分析、聚類分析以及偏最小二乘回歸分析等，可以區分樣品，直觀的看出各樣品之間的相似性和相異性。

Dias等人使用電子舌對山羊奶中摻假牛奶進行檢測，區分效果良好，5個基本傳感器響應情況有差異，其中酸、咸和鮮味物質敏感性較高，苦味和甜味兩個傳感器的響應程度較低[77-78]。有學者應用電子舌對未密封的巴氏殺菌乳進行檢測，同時測定樣品菌落總數和黏度指標，結果表明電子舌可以對不同保存時間的牛奶樣品清晰分類，并且可以對黏度和菌落總數進行很好的預測[78-79]。Madiha等人通過組合使用電子鼻和電子舌，對巴氏殺菌奶的儲存時間和品牌進行準確分類[79]。

5 結論

本文從奶中風味物質的前處理手段、分離鑒定技術以及感官評價方法幾方面進行總結。隨著仿生儀器出現和檢測技術的進步，主觀感官評價和客觀儀器分析相結合，使得我們對奶中揮發性風味物質的解析有一定的進展，對于優化加工工藝及控制產品質量等方面具有重要意義。

為滿足消費者進一步的需求，奶風味化學研究還需要更加深入，因此需要更多高通量的檢測技術作為支撐，改善針對不同奶產品的前處理方法，提高檢測技術的準確度和精密度。除風味組分的貢獻外，還需要對其生成途徑、反應機理及交互作用進行探討。建立系統、快速、有效的評價和監測體系，對原料奶及貨架期內奶制品的風味進行質量控制和監測，保證優質奶及奶產品的固有風味，以消費者喜好為導向，提升奶產品感官品質，改善消費體驗，從而推動我國奶業發展。