間質蛋白Periostin高表達對鼻咽癌6-10B細胞凋亡的影響及可能機制

肖 萍， 李 通， 楊曉玉， 李美香

(1.南華大學衡陽醫(yī)學院組織胚胎學教研室 應用解剖與生殖醫(yī)學研究所 顯微形態(tài)實驗中心, 湖南省衡陽市 421001;2.鄂州市中心醫(yī)院檢驗科，湖北省鄂州市 436000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種高發(fā)于中國南方及東南亞地區(qū)的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，易發(fā)生顱底浸潤或遠處轉移[1]。間質蛋白Periostin最初是作為一種黏附分子而被發(fā)現(xiàn)。有學者發(fā)現(xiàn)其在多數腫瘤間質中高表達，主要由癌周間質細胞分泌，能促進癌細胞的侵襲和轉移[2-3]。本課題組在前期研究中采用蛋白質組學結合質譜技術研究發(fā)現(xiàn)Periostin在鼻咽癌間質中表達上調[3]。眾所周知，腫瘤細胞的無限生長與腫瘤細胞的凋亡障礙有關[4]。P53基因是一種重要的抑癌基因，可以通過調控凋亡相關基因的表達及其產物的活性來促進細胞的凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白在鼻咽癌組織中過度表達[6]，但其在鼻咽癌中的促凋亡作用尚未得到系統(tǒng)的研究。本研究探討Periostin對鼻咽癌細胞凋亡的調節(jié)作用及其與P53蛋白的關系。

1 材料和方法

1.1 細胞分組及標本

穩(wěn)定轉染POSTN基因的低轉移潛能NPC細胞系6-10B細胞(對照組)、6-10B-GFP細胞(空白載體對照組)、6-10B-POSTN細胞(轉染組)均為本室凍存。66例鼻咽癌組織切片來源于中南大學湘雅醫(yī)院病理科，54例男性和12例女性，平均年齡(48±9)歲，臨床分期為Ⅱ到Ⅳ。

1.2 細胞培養(yǎng)

將各組細胞(6-10B/6-10B-GFP/6-10B-POSTN)復蘇后培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2、100%濕度的環(huán)境下培養(yǎng)傳代。

1.3 Western blot法

提取6-10B系列細胞總蛋白并進行蛋白含量測定。取40 μg總蛋白用10%SDS-PAGE進行分離，轉膜后封閉2 h；一抗Periostin(1∶2 000,ab14041)、P53(1∶1 000，ab90363,)、Bax(1∶1 000,ab32503)、Bcl-2(1∶1 000,ab185002)、anti-p-Akt(1∶5 000,ab38449)分別與印跡膜4 ℃孵育過夜;TBS-T洗膜3次×10 min;二抗室溫孵育1 h;TBS-T洗膜3次×10 min，ECL發(fā)光，顯影、定影。以GAPDH(1∶5 000,ab8245)為內參照。用Image J軟件分析目標條帶的灰度值(蛋白相對表達水平=目的蛋白組灰度值/內參灰度值)。

1.4 流式細胞術

收集生長狀態(tài)良好的6-10B系列細胞約2×106個于1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清。將1 mL預冷的PBS加入每管中，洗滌3次。細胞用100 μL的1×Annexin V結合緩沖液重懸，再加入PE-AnnexinⅤ、7-AAD染色，暗室中培養(yǎng)15 min，每管加入400 μL的1×Annexin V結合緩沖液，上機檢測。

1.5 細胞上清中分泌蛋白的濃縮

用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)各組細胞48 h，收集培養(yǎng)細胞的上清液，離心去除細胞碎片。濃縮培養(yǎng)上清至0.25 mL，加入等量蛋白裂解液(8 mol/L尿素，4% CHAPS，40 mmol/L Tris,65 mmol/L DTT)旋渦混勻裂解蛋白，15 000 g,4 ℃離心30 min，取上清。采用Bradford法(購自Pierce公司)測定蛋白的水平。Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達。

1.6 細胞轉染

取3×105個對數生長期的6-10B系列細胞接種在6孔板中，于轉染前24 h換成無血清培基培養(yǎng)過夜，使用Lipofectamine-2000(Life Technologies，Inc.)將質粒P53 shRNA(轉染組)及GV102(空白對照)轉染到準備好的各組細胞中。P53 shRNA靶序列：GACTCCAGTGGTAATCTAC。

1.7 免疫組織化學檢測

按試劑盒說明書操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟，下行入水。一抗為鼠抗人P53(1∶500，英國Abcam公司產品，ab90363)，4 ℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗；二抗為生物素化羊抗鼠IgG(1∶100稀釋)，DAB顯色，光鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗數據用Graphpad Prism8.0軟件進行作圖及統(tǒng)計學分析。Western blot條帶用Imag J軟件進行灰度值測定，所有實驗重復3次。各組間比較采用Studentt檢驗和單因素方差分析。P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 Periostin轉染效果驗證及對細胞內凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示Periostin在6-10B細胞中高表達(圖1A、B)。與對照組6-10B和6-10B-GFP組比較，6-10B-POSTN組中P53、Bax的表達顯著升高，p-Akt的表達水平明顯下降(P<0.05)，而Bcl-2的表達差異無顯著性(圖1B)，但Bax/Bcl-2的比值顯著升高(圖1C)，提示Perisotin可以下調p-Akt、上調Bax和P53蛋白的表達水平。

圖1 Periostin、P53、Bax、Bcl-2和p-Akt在6-10B系列細胞中的表達情況A為Western blotting技術檢測Periostin、P53、Bax、Bcl-2和p-Akt蛋白的表達；B為Periostin、P53、Bax、Bcl-2和p-Akt蛋白的定量分析;C為6-10B、6-10B-GFP和6-10B-POSTN中BAx/Bcl-2比值比較。a為P<0.05,與6-10B組或6-10B-GFP組比較。

2.2 POSTN高表達促進6-10B細胞的凋亡

與6-10B及6-10B-GFP組比較，6-10B-POSTN組細胞凋亡率升高(P<0.05；圖2、表1)。

圖2 POSTN基因轉染對6-10B細胞凋亡的影響

表1 POSTN基因轉染對各組細胞凋亡的影響 單位：%

2.3 6-10B-POSTN細胞培養(yǎng)上清促進6-10B細胞內凋亡相關蛋白的表達

與1640培基培養(yǎng)的6-10B細胞比較，凋亡相關蛋白在用6-10B細胞組及6-10B-GFP組培養(yǎng)上清刺激的6-10B細胞中的表達無統(tǒng)計學意義(圖3)，但在6-10B-POSTN組培養(yǎng)上清培養(yǎng)的6-10B細胞中，P53、Bcl-2表達較對照組(1640培基)、6-10B、6-10B-GFP培養(yǎng)上清組下調，p-Akt表達較對照組及6-10B組下調；而Bax表達上調(圖3B)，Bax/Bcl-2的比值顯著升高(圖3C)。提示Periostin可以上調Bax、下調p-Akt、Bcl-2和P53蛋白的表達水平。

圖3 6-10B系列細胞培養(yǎng)上清中Periostin對6-10B細胞內凋亡相關蛋白表達的影響A為1640培基、6-10B細胞、6-10B-GFP細胞和6-10B-POSTN細胞培養(yǎng)上清對P53、Bax、Bcl-2和p-Akt的影響;B為P53、Bax、Bcl-2和p-Akt蛋白水平的定量分析；C為不同細胞培養(yǎng)組上清中Bax/Bxl-2比值的比較。a為P<0.05,與1640培基組比較。

2.4 人正常鼻咽黏膜組織和鼻咽癌組織中P53蛋白表達的比較

與鼻咽黏膜正常組織比較，P53蛋白在NPC組織中的表達顯著上調(圖4)。

圖4 免疫組織化學方法檢測P53在正常鼻咽黏膜和鼻咽癌組織中的表達(蘇木精復染，200×)

2.5 鼻咽癌6-10B細胞轉染shRNA-P53后對6-10B細胞凋亡率的影響

與對照組GV102比較，P53蛋白在P53-shRNA組表達明顯下調(圖5)。FCM檢測結果顯示：與6-10B-GV102組比較，6-10B-shRNA和6-10B-GFP-shRNA組細胞凋亡率的差異均無顯著性，而6-10B-POSTN-shRNA組的凋亡率顯著高于其他3組(P<0.05；圖6)。

圖5 P53 shRNA轉染6-10B細胞后P53蛋白的表達

圖6 FCM檢測P53下調對6-10B細胞凋亡率的影響A為FCM檢測P53下調前后6-10B細胞的凋亡情況；B為各組細胞凋亡率的統(tǒng)計分析。a為P<0.05,與6-10B-GV102組、6-10B-shRNA組和6-10B-GFP shRNA組比較。

3 討 論

本研究利用本室凍存的高表達POSTN的6-10B穩(wěn)轉細胞株，探究了Periostin高表達對鼻咽癌6-10B細胞凋亡的影響及可能機理。研究結果發(fā)現(xiàn)6-10B細胞中Periostin蛋白的表達可促進6-10B細胞的凋亡，上調促凋亡蛋白P53和Bax的表達，下調存活因子p-Akt的表達。目前有較多的研究提示異常表達Periostin在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演的角色不同[7]。不少研究報道在癌組織中Periostin表達下調，可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，認為其是一種抑癌蛋白，而表達上調的Periostin可促進腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移，認為其是一種促癌蛋白[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Periostin在NPC組織中高表達，細胞實驗顯示高表達的Periostin可促進NPC細胞的侵襲和遷移[3]。在本研究中，低轉移潛能6-10B細胞中高表達Periostin蛋白后細胞中促凋亡因子P53和Bax表達上調，Bax/Bcl-2比值升高，存活因子p-Akt的表達被抑制，凋亡率較對照組顯著升高。研究結果提示：6-10B細胞內高表達的Periostin可促進6-10B細胞的凋亡。

本研究用6-10B-POSNT細胞培養(yǎng)上清刺激6-10B細胞后，細胞中促凋亡蛋白Bax的表達顯著上調，Bax/Bcl-2的比值顯著升高，促進細胞存活的蛋白Bcl-2、p-Akt的表達顯著下調，差異均有顯著性。以上結果提示：自分泌和旁分泌的Periostin都可以促進NPC細胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)60%以上鼻咽癌組織中存在P53蛋白的聚集[5,10-11]。P53蛋白在NPC組織中高表達，自分泌表達于NPC細胞內的Periostin可促進6-10B細胞內P53的表達，而旁分泌的Periostin卻抑制6-10B細胞內P53的表達，而無論是自分泌還是旁分泌的Periostin均可促進6-10B細胞的凋亡。6-10B系列細胞中P53基因下調后，結果顯示其對6-10B細胞的凋亡率沒有明顯影響，提示在6-10B細胞中P53沒有發(fā)揮促凋亡的功能；轉染了POSTN基因的6-10B細胞中，P53基因的下調也并沒有影響Periostin對凋亡的促進作用。本文實驗結果說明Periostin可以促進6-10B細胞的凋亡，但其不是通過P53途徑來實現(xiàn)的，其具體機制還有待后續(xù)的進一步研究。