核酸適配體修飾聚酰胺-胺負載5-氟尿嘧啶納米給藥體系的制備表征及體外抗肝癌作用

歐陽湖， 寧 玲， 陳思維， 賀冬秀， 王 肖， 何 健， 謝偉全

(南華大學衡陽醫學院藥物藥理研究所，湖南省衡陽市 421001)

ConclusionsThe preparation method of ZY1-PAMAM-FUA is simple, and the ZY1-PAMAM-FUA drug delivery system has splendid stability and biocompatibility. It can effectively deliver drugs to SMCC-7721 cells to inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma cells.

肝細胞癌是臨床上常見且病死率極高的惡性腫瘤，化療是肝癌臨床首選治療方法,由于化療藥物組織特異性差，對正常組織產生毒副作用，限制了其臨床治療，肝癌靶向治療越來越受到人們關注。眾多研究證實，腫瘤主動靶向給藥體系能將藥物有效遞送至病變部位，可明顯增強化療藥物的選擇性，增強療效降低毒副作用[1]。適配體是能夠特異性地結合細胞、蛋白質等的寡聚單鏈DNA或RNA[2]，具有高特異性、穩定性好和易化學合成等優點，在腫瘤診療中顯示巨大的應用潛力[3]。越來越多研究利用核酸適配體修飾聚合物、脂質體、納米顆粒等不同類型藥物載體用于靶向肝癌的藥物遞送[4]。聚酰胺-胺(polyamidoamine，PAMAM)具有低毒、無免疫原性等優點，其表面存在眾多活性基團能被多種分子修飾而被用做藥物載體[5-6]。本文以一線抗肝癌藥5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)為模型藥物，對其修飾轉化成帶羧基的FUA[7]，將FUA和聚乙二醇(PEG)分別與PAMAM偶聯獲得PEG-PAMAM-FUA，再與適配體(ZY1)通過靜電結合制備肝癌靶向ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系，并研究其體外抗肝癌作用。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

UV-1750紫外-可見分光光度計(島津Shimadzu公司，日本)；核磁共振儀(EFT-60，美國Anasazi公司)；Nano ZS90納米粒徑及Zeta電位分析儀(Malvern儀器有限公司，英國)；酶標儀(Biotek儀器有限公司,美國)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；透析袋(美國Spectra/Pro)；細胞培養箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。5-氟尿嘧啶(美國Sigma公司)；核酸適配體(上海生工生物股份有限公司)；樹狀大分子聚酰胺-胺(5代，相對分子質量28 826，威海晨源分子新材料有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris·HCl)(上海麥克林生化科技有限公司)；肝癌細胞SMMC-7721購于中科院上海生命科學研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系的制備

將420 nmol FUA與504 nmol EDC和504 nmol NHS在室溫下攪拌活化后緩慢滴加至N2氛圍下的PAMAM溶液中并在室溫下繼續反應過夜(得到PAMAM-FUA)。隨后將PEG-COOH用同樣方法活化后滴加至PAMAM-FUA溶液中繼續反應24 h，反應結束后透析2天并冷凍干燥得到PEG-PAMAM-FUA。最后通過靜電吸附作用將核酸適配體(ZY1)與PEG-PAMAM-FUA綴合，經冷凍干燥得ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系。

1.3 納米給藥體系化學結構表征分析

用水作為空白對照除去背景影響后，用UV-1750紫外分光光度計分別測定FUA、PEG-PAMAM-FUA、ZY1-PAMAM-FUA的紫外吸收譜圖。先將KBr片置于紅外光譜儀中除去KBr的背景影響。隨后分別取1 mg FUA、PAMAM-FUA與199 mg KBr混合研磨壓片并檢測FUA、PAMAM-FUA的紅外吸收譜圖。

配制PAMAM-FUA與ZY1-PAMAM-FUA溶液用納米粒度及Zeta電位分析儀檢測PAMAM-FUA與ZY1-PAMAM-FUA的粒徑跟Zeta電位。將FUA、PAMAM-FUA溶解于氘代二甲基亞砜中，用核磁共振氫譜儀(Varian)檢測FUA、PAMAM-FUA的化學結構。

1.4 納米給藥體系載藥量考察

配制0.5、1、2、5、10、15、20 mg/L FUA溶液。以水為空白參比，用紫外分光光度法檢測，以光密度值(OD)對質量濃度(c)進行線性回歸，求得FUA標準曲線方程。

將1 g/L PAMAM-FUA溶液與1 mol/L和5 mol/L KOH混勻后在3 000 r/min下離心12 min。取上清液稀釋后于273 nm波長處測定其光密度求得上清液中FUA量(即未與PAMAM偶聯的藥物量)，根據未與PAMAM偶聯的藥物量從而間接求得PAMAM-FUA體系中的載藥量(n=3)，載藥量(%)=(納米體系藥物含量/納米體系質量)×100%。

1.5 納米給藥體系體外釋放性能考察

配制pH為7.4、6.8和5.0的Tris緩沖溶液和1 g/L ZY1-PAMAM-FUA溶液。取3 mL ZY1-PAMAM-FUA溶液裝至透析袋中(截留相對分子質量為3 500)，隨后將透析袋轉移至不同pH環境中，在37 ℃考察FUA的體外釋放性能。

在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144 h，分別取袋外釋放液在273 nm處測定釋放液光密度值，并根據FUA標準曲線方程計算各時間點釋放液中FUA質量濃度，隨后進一步計算FUA的累積釋藥率，累計釋藥率(%)=(藥物實際釋放質量/納米給藥體系藥物總質量)×100%。

1.6 納米給藥體系穩定性考察

取適量PAMAM-FUA分別用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、生理鹽水(Saline)復溶，然后用納米粒度及Zeta電位分析儀測定納米給藥體系在上述兩種溶液中1周內粒徑變化，觀察納米給藥體系是否有聚集或降解，以此來考察PAMAM-FUA的穩定性。

1.7 SMMC-7721肝癌細胞對納米給藥體系攝取能力考察

將SMMC-7721、Bel-7402、L02細胞接種至6孔板中，在3孔中加入2 mL無血清培養基，另外3孔中加入2 mL含ZY1-PAMAM-FUA培養基，混勻后孵育4 h。隨后先用多聚甲醛固定細胞15 min，再用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min，潤洗后置于倒置熒光顯微鏡下觀察不同細胞對ZY1-PAMAM-FUA的攝取情況。如上所述，將SMMC-7721細胞接種至6孔板中并在每孔中加入含不同比例ZY1的ZY1-PAMAM-FUA，隨后用流式細胞儀檢測SMMC-7721細胞對不同比例ZY1-PAMAM-FUA的攝取情況來篩選最優的ZY1投料比。

1.8 納米給藥體系生物相容性評價

將正常肝細胞L02和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)接種到96孔板中培養24 h。配制含500、250、125、62.5、31.25 mg/L共5個質量濃度的5-Fu和ZY1-PAMAM-FUA的低血清培養基溶液加入到相應孔中繼續孵育24、48 h。到達相應時間點后，加入MTT繼續孵育4 h，隨后用酶標儀檢測每孔的OD值來評價ZY1-PAMAM-FUA的細胞相容性。

先配制2%新西蘭兔血，配制同樣5個質量濃度的5-Fu和ZY1-PAMAM-FUA，以純化水作為陽性對照。將0.5 mL兔血跟0.5 mL 5-Fu或ZY1-PAMAM-FUA混合靜置3 h后在3 500 r/min下離心10 min，取上清液100 μL在540 nm處檢測各組上清液OD值來評價ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系的血液相容性，溶血率(%)=[(樣品組OD-陰性對照組OD)/(陽性對照組OD-陰性對照組OD)]×100%。

1.9 納米給藥體系抗肝癌細胞增殖作用評價

將SMMC-7721細胞種入到96孔板中與不同質量濃度的5-Fu和ZY1-PAMAM-FUA共孵育24 h和48 h后檢測各孔的光密度值(OD)來計算腫瘤細胞增殖情況。細胞存活率(%)=[(藥物組OD-空白對照組OD)/(陰性對照組OD-空白對照組OD)]×100%。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系的化學結構表征

由圖1A可見，FUA的最大吸收波長λmax=273 nm，ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系的λmax=276 nm較FUA有紅移，這是由于FUA與PAMAM反應形成了酰胺鍵使得共軛效應增強從而λmax向長波長移動。由圖1B可見，PEG-PAMAM-FUA在3 447/cm和1 553/cm有對應氨基上N-H的伸縮振動和彎曲振動的特征峰，在1 641/cm處有對應酰胺鍵上—(C=O)—伸縮振動的特征吸收峰，以及在953/cm處有對應—CF伸縮振動的特征吸收峰。由圖1C和圖1D對峰的歸屬可見，FUA、PEG均與PAMAM成功偶聯，通過對峰面積進行積分計算出每個PAMAM上偶聯了3個PEG鏈段。根據紫外光譜圖、紅外光譜圖和核磁共振氫譜圖的結果，ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系被成功制備。

圖1 ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系的化學結構表征A為紫外光譜圖;B為紅外光譜圖;C為PEG-PAMAM-FUA核磁共振氫譜圖;D為FUA核磁共振氫譜圖;E為PAMAM-FUA粒徑分布;F為PEG-PAMAM-FUA粒徑分布;G為ZY1-PAMAM-FUA粒徑分布;H為ZY1-PAMAM-FUA Zeta電位圖譜。

由圖1E～H可見，PAMAM-FUA平均粒徑為130.2 nm，PDI為0.201；PEG-PAMAM-FUA平均粒徑為169.9 nm，PDI為0.259；ZY1-PAMAM-FUA平均粒徑為102.3 nm，PDI為0.215，其Zeta電位為+13.9 mV。PEG-PAMAM-FUA較PAMAM-FUA的粒徑增大是由于連接上PEG鏈段后，PEG鏈段在水溶液中伸展而使得納米給藥體系的粒徑增大；而ZY1與PAMAM-FUA通過靜電吸附原理綴合后，讓納米粒子的結構更加緊密所以納米給藥體系的粒徑有減小。

2.2 納米給藥體系的載藥量

由圖2所示，以FUA質量濃度對光密度OD進行線性回歸，得標準曲線方程為y=0.0419c+0.0031，線性回歸系數R2=0.9997,表明FUA在0.5～20.0 mg/L范圍內，其質量濃度與光密度之間存在良好的線性關系。基于此標準曲線，按照1.4所述的載藥量測定方法得出PAMAM-FUA的載藥量為8.70%±0.43%。

圖2 FUA標準曲線

2.3 納米給藥體系的體外釋放性能

由圖3所示，ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系在不同pH介質中均具有良好的緩釋性能，此外ZY1-PAMAM-FUA在上述模擬不同pH體液環境下具有一定的pH敏感性，在弱酸性的腫瘤微環境下能夠更加快速地釋放，以更大發揮5-Fu的抗腫瘤作用。

圖3 ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系體外藥物釋放情況(n=3)

2.4 納米給藥體系的穩定性

由圖4可見，PEG-PAMAM-FUA納米粒子在PBS和Saline中的粒徑一直處于164.2 nm附近，既沒有聚集形成的大顆粒也無降解形成的小顆粒，結果證明PEG-PAMAM-FUA在類生理條件下能夠保持穩定，也進一步說明該納米載藥體系適宜體內應用。

圖4 納米給藥體系在不同條件下的穩定性(n=3)

2.5 SMMC-7721肝癌細胞對納米給藥體系的攝取能力

如圖5所示，核酸適配體ZY1修飾的PAMAM-FUA納米給藥體系能夠特異性靶向至SMMC-7721細胞，且幾乎不被正常肝細胞L02攝取，該結果說明ZY1能夠特異性識別靶細胞SMMC-7721，可以選擇性地將化療藥物5-Fu遞送至腫瘤細胞發揮抗腫瘤效果。從組合圖來看，雖然僅有小部分的ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系已經進入到細胞內，大部分的熒光仍分布在細胞膜表面，但在這種情形下可以通過延長共孵育的時間來增加納米給藥體系被攝取至細胞內的量。

圖5 熒光顯微鏡觀察SMMC-7721肝癌細胞對ZY1-PAMAM-FUA給藥體系的攝取能力(200×)

由圖6可見，在加入3.75×10-2、5.00×10-2、6.25×10-2、7.50×10-2nmol/L的ZY1時，SMMC-7721細胞對ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系的攝取量幾乎沒有差異，提示ZY1投入量為3.75×10-2nmol/L時，ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系達到靶向SMMC-7721細胞的最優效果。

圖6 流式細胞術檢測SMMC-7721肝癌細胞對ZY1-PAMAM-FUA給藥體系的攝取能力

2.6 納米給藥體系的生物相容性

生物相容性是納米載藥體系是否適宜體內應用的關鍵。溶血實驗是考察納米載藥體系能否適宜體內注射給藥的關鍵，當溶血率低于5%時認為該體系的血液相容性良好；而良好的細胞相容性，則是改善化療藥物毒副作用的重要方法。

由于PAMAM表面具有高密度的正電荷，易與帶負電的細胞膜結合使得細胞膜破裂而產生毒性，所以在其表面修飾上惰性的PEG分子來改善其毒性。由圖7所示，偶聯PEG后能夠顯著降低PAMAM-FUA和5-Fu對L02和HUVEC的毒性；另外，ZY1-PAMAM-FUA的溶血率即使在高質量濃度下也低于5%。以上結果說明，ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系具有良好的生物相容性。

圖7 ZY1-PAMAM-FUA給藥體系的生物相容性(n=3)a為P<0.05，與PAMAM-FUA組比較；b為P<0.05，與5-Fu組比較。

2.7 納米給藥體系的抗肝癌細胞增殖作用

由圖8所示，5-Fu和ZY1-PAMAM-FUA給藥體系對SMMC-7721細胞增殖均具有明顯抑制作用，呈現出時間依賴性和劑量依賴性。與游離5-Fu比較，ZY1-PAMAM-FUA在高質量濃度呈現出相當甚至更好的抑制增殖效果，這可能是因為通過ZY1的主動靶向作用納米給藥體系能更早的被細胞攝取，其次則是因為ZY1-PAMAM-FUA帶有正電荷，能夠與細胞膜結合，可以進一步增加納米給藥體系被攝入胞內的量。

圖8 ZY1-PAMAM-FUA和5-Fu對SMMC-7721細胞增殖活性的影響(n=3)a為P<0.05，與5-Fu組比較。

3 討 論

本研究采用共價交聯法和靜電吸附原理制備出了粒徑均勻、穩定、生物相容性好的ZY1-PAMAM-FUA納米給藥體系。該納米給藥體系具有良好的緩釋性能，在酸性環境下能更快速地釋放；此外通過核酸適配體(ZY1)的介導，ZY1-PAMAM-FUA能夠高效地識別并將5-Fu遞送至SMMC-7721細胞增強5-Fu抗肝癌效果的同時也顯著降低5-Fu對正常細胞的毒副作用。

本研究中的創新主要體現在：①將5-Fu溴乙酸化制備為5-氟尿嘧啶-1-基乙酸(FUA)前藥，既讓帶羧基的FUA能與PAMAM通過酰胺反應偶聯避免物理包封5-Fu產生的泄露，也能一定程度上降低5-Fu毒副作用[7]；②選定具有肝癌靶向性的核酸適配體作為配體，能提高納米給藥體系靶向性能，也能為腫瘤的靶向治療和核酸適配體的應用提供新思路[8-9]。然而本研究使用PEG修飾PAMAM-FUA，雖一定程度上降低了PAMAM-FUA的細胞毒性但與此同時也降低了納米給藥體系的載藥量，后續可以優化PEG的連接量來提高體系的載藥量，還可以基于腫瘤微環境來設計pH敏感型或氧化還原敏感型的納米載藥體系來提高藥物在腫瘤部位的釋放率，釋放速度和降低藥物在正常體液環境中的泄露釋放[1,9-10]；此外還可以設計既具有腫瘤靶向性又具有熒光性能的核酸適配體來介導納米給藥體系，此時的納米給藥體系不僅能主動靶向遞送至腫瘤部位且還具有示蹤納米載藥體系體內分布的特性[2,11]。