二氫楊梅素通過PI3K/Akt信號通路調節巨噬細胞極化抑制卵巢癌細胞的侵襲

譚武鵬， 譚 雄， 伍菊花

(衡陽市婦幼保健醫院婦科，湖南省衡陽市421001)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是發病率為第三位的惡性婦科腫瘤，但其死亡率卻高居婦科腫瘤的第一位[1]。卵巢癌的發病隱匿，早期的臨床癥狀不明顯，很多患者在發現并被確診時已經處于中晚期，因而預后并不理想[2]。細胞的侵襲性生長是導致OC治療失敗的重要原因，腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAM)是腫瘤微環境的重要部分之一，與腫瘤細胞的侵襲性生長方式具有密切的關系[3]。二氫楊梅素(dihydromyrietin,DMY)是一種從植物中提取到的黃酮類化合物[4]。DMY的藥理作用很廣泛，如抗炎、鎮痛、抗氧化和調節免疫力等[5-6]。本研究擬觀察DMY處理的RAW264.7巨噬細胞對人卵巢癌細胞系SKOV3細胞增殖和侵襲能力的影響，并從PI3K/Akt/巨噬細胞極化信號途徑的角度探討其可能的機制，為卵巢癌的防治提供新的靶點和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞系SKOV3細胞由中國科學院上海庫提供，RAW264.7巨噬細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。胰蛋白酶和DMEM培養基購自Gibco公司。小牛血清購自四季青生物科技公司。干擾素-γ(interferon gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素-10(interleukin10,IL-10)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑購自武漢博士德生物工程公司。細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)細胞增殖檢測試劑盒購自漢恒生物科技公司。DMY購自曼斯特生物科技公司。

1.2 細胞培養

RAW264.7細胞和SKOV3細胞均用DMEM培養液(10%含小牛血清)培養，細胞培養在37 ℃、5%CO2培養箱中。

1.3 實驗分組

實驗分為RAW264.7細胞組(RAW組)、SKOV3細胞組(SKOV3組)、RAW264.7細胞+DMY組(DMY+RAW組)、RAW264.7細胞+SKOV3細胞組(RAW+SKOV3組)、DMY+RAW264.7細胞+SKOV3細胞組(DMY+RAW+SKOV3組)。RAW組和SKOV3組均用DMEM培養基(含10%小牛血清)培養24 h；DMY+RAW組用DMY(60 mg/L)處理RAW264.7細胞24 h；RAW+SKOV3組用DMEM培養基(含10%胎牛血清)對兩種細胞進行非接觸共培養24 h；DMY+RAW+SKOV3組先用DMY(60 mg/L)處理RAW264.7細胞24 h，更換培養基，再將RAW264.7細胞和SKOV3細胞非接觸共培養24 h。

1.4 CCK-8檢測SKOV3細胞增殖水平

將對數生長期的SKOV3細胞制備成細胞懸液，接種于96孔培養板。在處理結束后，取CCK8試劑溶液10 μL加到培養孔，靜置于室溫下4 h，然后在37 ℃、5%CO2培養箱中再繼續培養1 h。用只含培養基的空白對照孔進行校正，把酶標儀的波長調為450 nm，檢測各培養孔的光密度值(OD值)。

1.5 Transwell檢測SKOV3細胞的侵襲能力

將RAW264.7細胞制備成細胞懸液，接種于24孔培養板，密度為1×105個/孔。取半透膜(孔徑為8.0 μm)放置到Transwell上室的底部。制備好基質膠，取80 μL預先制備好的基質膠，加入到Transwell的上室，置于37 ℃條件下過夜，使其固化。把SKOV3細胞制備成細胞懸液，接種于Transwell的上室中，密度為3×105個/孔。再將Transwell小室置于已經接種了RAW細胞的培養板孔中，建立非接觸共培養系統。實驗處理結束后取出上室，將其浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定15 min。然后在0.1%結晶紫溶液中染色30 min。取出Transwell小室，擦干水分。顯微鏡下觀察結果，每個樣本隨機取視野5個，計數穿過了基質膠的細胞。

1.6 酶聯免疫法檢測IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平

收集細胞培養液上清，ELISA法檢測IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平。按照試劑盒說明書操作。采用BCA法檢測細胞培養上清液中總蛋白水平，結果采用ng/g蛋白表示。

1.7 Western blot檢測PI3K和Akt蛋白的表達

提取巨噬細胞的總蛋白和核蛋白，按照試劑盒說明書操作。通過BCA法檢測樣本的蛋白水平。取適量的總蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸充分變性蛋白。凝膠電泳分離蛋白后，電轉的方法把蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinyl fluoride,PVDF)膜上。將PVDF膜與脫脂牛奶在室溫下孵育2 h。加入兔抗人PI3K(1∶400)、p-PI3K(1∶300)、Akt(1∶500)和p-Akt(1∶500)的一抗，4 ℃過夜。Tris-Tween緩沖液洗膜3次，加入二抗，4 ℃下孵育4 h，Tris-Tween緩沖液洗膜3次。曝光、顯影、定影操作，使用圖像分析軟件掃描膠片。核蛋白檢測采用的內參是組蛋白，其他內參均是β-actin，對目的蛋白表達水平進行半定量分析。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 各組SKOV3細胞增殖和侵襲能力的比較

與SKOV3組比較，RAW+SKOV3組SKOV3細胞的增殖水平及侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05；圖1)。與RAW+SKOV3組比較，DMY+RAW+SKOV3組SKOV3細胞的增殖水平及侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05；圖1)。

圖1 各組SKOV3細胞增殖和侵襲能力的比較a為P<0.05，與SKOV3組比較；b為P<0.05，與RAW+SKOV3組比較。

2.2 各組培養液上清中細胞因子水平的比較

與RAW組比較，DMY+RAW組培養液上清中IFN-γ和TNF-α的水平顯著升高，而IL-10和TGF-β的水平顯著降低(均P<0.05；圖2)。

圖2 各組培養液上清中細胞因子水平的比較a為P<0.05，與RAW組比較。

2.3 RAW264.7巨噬細胞中PI3K和Akt蛋白表達

與RAW組比較，DMY+RAW組RAW264.7細胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表達水平均顯著升高(均P<0.05；圖3)。

圖3 RAW264.7巨噬細胞中PI3K和Akt蛋白表達a為P<0.05，與RAW組比較。

3 討 論

OC是女性生殖系統中的常見惡性腫瘤之一，具有較強的侵襲性[7]。腫瘤微環境是影響腫瘤侵襲性的重要因素，TAM是實體瘤中腫瘤微環境的重要組成部分，在腫瘤的發展進程中發揮了關鍵作用[8]。DMY是一種從藤茶中分離出來的黃酮醇類化合物[9]，藥理學功效廣泛，如殺菌、鎮痛、止咳和增強免疫力等[10]。DMY促進肺癌細胞系A549細胞凋亡，機制與上調Bax蛋白和下調Bcl-2表達有關[11]。DMY能減少小鼠乳腺癌肺轉移瘤的瘤重和肺轉移灶的數量[12]。本研究結果顯示DMY預處理RAW巨噬細胞，顯著降低RAW細胞誘導的SKOV3細胞的增殖和侵襲能力，這提示DMY可抑制TAM誘導的卵巢癌細胞的增殖和侵襲，但是其機制還不清楚。

巨噬細胞具有兩種不同的功能表型，即經典活化(M1型)和替代活化(M2型)，被稱為巨噬細胞極化[13]。M1型巨噬細胞有促炎反應和殺傷腫瘤細胞等作用。M2型巨噬細胞有抑制炎癥和促進腫瘤侵襲等作用[14]。PI3K/Akt信號通路是調控巨噬細胞極化的重要信號途徑[15-16]。本研究結果顯示DMY處理顯著升高共培養體系培養液中TNF-α和IFN-γ時，能降低TGF-β和IL-10水平。DMY顯著上調RAW巨噬細胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表達水平。這提示DMY可誘導RAW巨噬細胞向M1型極化，這可能是DMY抑制卵巢癌細胞系SKOV3細胞的增殖和侵襲的機制之一。

總之，DMY抑制TAM誘導的SKOV3細胞增殖和侵襲，其機制與通過PI3K/Akt信號通路調節TAM的極化有關，該研究將為卵巢癌的防治提供新的靶點和策略。