GRP78蛋白在胃癌中的表達(dá)及作用

李素云， 袁靖哲， 李 玄， 孟星圻， 劉 軒， 鄧 靖， 賀修勝

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院 1.應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，2.臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，3.腫瘤研究所，4.預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，湖南省衡陽市 421001)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人們的生命與健康。由于胃癌早期癥狀不明顯，所以多數(shù)胃癌患者就診時已為中晚期，且其療效欠佳，5年生存率低。研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與多種基因表達(dá)異常有關(guān)，蛋白質(zhì)是基因的表達(dá)產(chǎn)物，可作為胃癌發(fā)生的診斷標(biāo)志物。目前臨床用于判斷胃癌發(fā)生的標(biāo)志物主要有CEA、CA72-4和CA19-9，但其特異性不高[1-2]。因此，篩選并鑒定胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物，尋找早期診斷的新方法，是胃癌早診斷、早治療、改善患者生活質(zhì)量及提高5年生存率的關(guān)鍵。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)也稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白。GRP78蛋白高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，參與腫瘤細(xì)胞增殖、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移及血管新生等病理和病理生理過程，GRP78蛋白可作為腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志物，但其在胃癌組織中表達(dá)情況及作用機(jī)制尚不清楚[3-4]。本研究觀察GRP78蛋白在胃癌組織中表達(dá)水平及其對胃癌細(xì)胞系增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本與細(xì)胞

胃癌標(biāo)本48例，癌旁正常胃黏膜組織28例(癌旁5 cm以上)，均由南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科贈予。胃癌標(biāo)本中高、中分化32例，低分化16例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織26例，手術(shù)取材后立即放入液氮罐中保存，經(jīng)甲醛固定，制成石蠟切片以備用。SGC-7901及GRP78-shRNA2-SGC-7901細(xì)胞株由腫瘤研究所保存。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone公司；胎牛血清購自四季青公司；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購自Genview公司、DMSO購自Solarbio公司；EDTA購自Sigma公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；鼠抗人單克隆抗體GRP78購自Abcam公司；鼠抗人GAPDH多克隆抗體購于上?？泼羯锟萍加邢薰?；HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體購于武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測GRP78蛋白的表達(dá)

制作石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色法分析GRP78蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)。二甲苯和梯度酒精脫水處理切片；EDTA抗原緩沖液置微波抗原修復(fù)，PBS洗3次，每次5 min；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；3%牛血清白蛋白封閉；PBS清洗3次，每次5 min；一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min；二抗孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min；DAB顯色。

1.4 MTT法檢測GRP78對胃癌細(xì)胞增殖的影響

用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基配成細(xì)胞液，每孔100 μL，約2 000個細(xì)胞接種至96孔板，設(shè)3個復(fù)孔；置37 ℃、5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120 h后取出，每孔加20 μL MTT溶液，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，每孔加160 μL DMSO，振蕩12 min，充分融解結(jié)晶；酶標(biāo)儀490 nm波長處進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果。以增長率或者抑制率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制出細(xì)胞生長曲線圖。

1.5 Transwell方法檢測GRP78對胃癌細(xì)胞侵襲遷移的影響

基質(zhì)膠鋪板，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞水平至1×106/mL；接種細(xì)胞，取100 μL加至Transwell小室的上室，在下室中加600 μL完全培養(yǎng)液；置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，用棉簽擦去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗1次，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞穿過小孔情況，拍照并統(tǒng)計穿過的細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

2.1 各組GRP78蛋白陽性表達(dá)比較及其與臨床病理特征的關(guān)系

GRP78蛋白表達(dá)產(chǎn)物GRP78蛋白位于胞質(zhì)，且在胃癌組織中GRP78蛋白較正常胃黏膜組織明顯增加(圖1)。其陽性表達(dá)率與胃癌的直徑、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05；表1)。

表1 胃癌組織中GRP78蛋白表達(dá)與臨床病理特征分析 單位：例(%)

圖1 免疫組化檢測GRP78蛋白在不同胃癌組織中的表達(dá)情況(結(jié)晶紫染色，40×)A為正常胃黏膜；B為癌旁組織；C為胃轉(zhuǎn)移癌；D為高分化胃癌組織；E為中分化胃癌組織；F為低分化胃癌組織。

2.2 GRP78蛋白對SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響

與SGC-7901組比較，GRP78-shRNA2組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，即下調(diào)GRP78蛋白能抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的增殖能力(圖2)。

圖2 MTT檢測GRP78-shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響a為P<0.05,與SGC-7901比較。

2.3 GRP78蛋白對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響

GRP78-shRNA2組遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于SGC-7901組(P<0.05；圖3)，即下調(diào)GRP78蛋白表達(dá)能降低SGC-7901胃癌細(xì)胞的遷移能力。

圖3 Transwell檢測GRP78低表達(dá)對SGC-7901胃癌細(xì)胞遷移能力的影響A為結(jié)晶紫染色(40×)；B為遷移細(xì)胞數(shù)直方圖。a為P<0.05,與SGC-7901比較。

3 討 論

近年來，應(yīng)用微陣列及比較基因組雜交等技術(shù)對胃癌細(xì)胞DNA或mRNA進(jìn)行了研究，明確了部分與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因[2]。蛋白質(zhì)是生命功能活動的執(zhí)行者，基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)后，還將進(jìn)行折疊或修飾才能發(fā)揮其功能，因此，從基因水平不能全面反映出胃癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變化。隨著蛋白組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白質(zhì)分子，為尋找胃癌早期診斷標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)[5]。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78以分子伴侶形式參與蛋白質(zhì)折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)，附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，屬于應(yīng)激蛋白，缺氧和低糖環(huán)境呈高表達(dá)狀態(tài)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，GRP78蛋白高表達(dá)于肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中，其蛋白的高低可作為腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志物，且GRP78蛋白在腫瘤細(xì)胞化療耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-8]，GRP78蛋白是通過何種機(jī)制參與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚不清楚，但GRP78蛋白在多種腫瘤高表達(dá)，提示GRP78蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能扮演著重要角色。GRP78蛋白通過多種信號通路，廣泛參與了腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡抵抗、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移和血管新生等病理和病理生理過程[9]。有研究報道，GRP78蛋白對細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，并經(jīng)過未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，使細(xì)胞數(shù)量增多[10]。腫瘤細(xì)胞表面GRP78蛋白是腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和活性的重要調(diào)節(jié)劑，能快速激活細(xì)胞表面其他蛋白受體或配體，能通過磷酸肌醇Ⅲ激酶/Akt信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移[11-13]。然而，有關(guān)GRP78在胃癌組織中表達(dá)的臨床病理意義及其在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達(dá)水平，并分析其與胃癌轉(zhuǎn)移、臨床分期和病理分型等臨床指標(biāo)，結(jié)果表明GRP78蛋白高表達(dá)于胃癌組織中，其表達(dá)與胃癌的直徑、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、復(fù)發(fā)等有關(guān)。課題組前期成功建立了GRP78-shRNA2-SGC-7901胃癌細(xì)胞株[14]，通過MMT檢測GRP78蛋白低表達(dá)時對SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響；Transwell結(jié)果表明，降低GRP78蛋白表達(dá)能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和遷移能力。綜上，GRP78蛋白可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。