NOD 樣受體在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

王橋 宋波 馮博 季佳 李佐強

（齊齊哈爾醫學院 1 附屬第二醫院口腔科,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2 臨床病原教研室;3 齊齊哈爾五官醫院口腔科;4 齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院教研科）

口腔頜面部惡性腫瘤約占人體惡性腫瘤的3%，其中90%以上為鱗狀細胞癌，其局部復發性高，預后差，晚期生存率低，導致患者即使存活下來也由于手術造成的面部缺損，而嚴重影響患者的心理和生活質量〔1～3〕。口腔鱗狀細胞癌（OSCC）目前發病機制不甚明了，但研究顯示基因的突變及信號通路的失控在OSCC 的發生發展過程發揮著重要作用〔2，4，5〕。核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）即NOD 樣受體，是一種位于細胞質內的模式識別受體，能夠非特異性的識別各種致病微生物，在微生物感染中具有重要作用，在腫瘤中的研究較少〔6，7〕。本文將檢測NOD 樣受體在OSCC 中的表達，從而探討NOD 樣受體在OSCC 發生發展過程中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2016 年10 月至2019 年10 月齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院做過手術切除的82 例石蠟標本，患者經病理檢查證實為OSCC，術前均未接受放、化療。患者年齡28～76 歲，中位年齡51.5歲。男46 例，女36 例。＜50 歲30 例，≥50 歲52例。低分化48 例，中分化19 例，高分化15 例。根據國際TNM 國際分期:Ⅰ期18 例、Ⅱ期19 例、Ⅲ期24 例、Ⅳ期21 例。另外選取82 例距離癌組織＞5 cm的癌旁舌正常黏膜組織作為對照。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人NOD1 及NOD2 多克隆抗體均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。BH-2 顯微鏡購于日本OLYMPUS 公司。

1.3 免疫組化法檢測NOD1 及NOD2 表達 石蠟標本60℃烤片30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，100%、95%、85%、75% 酒精脫水，3% H2O2室溫滅活30 min，檸檬酸鹽溶液煮沸2 min 進行抗原修復，滴加一抗（兔抗人NOD1 及NOD2 多克隆抗體）4℃過夜孵育、二抗室溫孵育，DAB 顯色，蘇木素復染并封片，最后在光鏡下觀察蛋白的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷 NOD1 及NOD2 蛋白主要定位于細胞質中，當出現棕黃色或棕褐色顆粒，說明為陽性表達。兩名病理科醫生進行閱片。根據細胞染色強度判定:無染色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。根據陽性細胞比率判定:未著色為0 分，1%～25% 為1 分，26%～50% 為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。最后根據染色強度評分與陽性細胞比率評分的乘積作為最終的染色評分:陰性（-，0～2 分），弱陽性（+，3～4 分），中等陽性（荻，5～8 分），強陽性表達（莘，9～12分）。≥3 分說明細胞陽性表達。

1.5 數據分析 采用SPSS17.0 軟件進行χ2檢驗，Pearson 相關分析。

2 結果

2.1 OSCC 組織及癌旁舌正常黏膜組織中NOD1 及NOD2 的表達 OSCC 組織中NOD1、NOD2 的陽性表達明顯低于癌旁舌正常黏膜組織（均P＜0.001），見表1。

表1 NOD1 及NOD2 在OSCC 組織及癌旁舌正常膜組織中的表達〔n(%),n=82〕

2.2 NOD1 及NOD2 表達與OSCC 患者臨床病理參數的關系 Ⅲ～Ⅳ期NOD1 及NOD2 陽性表達率顯著低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.01，P＜0.001），有淋巴結轉移NOD1 及NOD2 陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移（P＜0.001），低分化中NOD1 及NOD2 陽性表達率顯著低于中高分化（均P＜0.001）。而OSCC 組織中NOD1 及NOD2 陽性表達率與年齡、性別無關。見表2。

表2 NOD1 及NOD2 陽性表達與OSCC 患者臨床病理參數的關系〔n(%)〕

2.3 OSCC 組織NOD1 及NOD2 表達的相關性 OSCC1 組織中，NOD1 與NOD2 表達正相關（r=0.556，P＜0.01）。

3 討論

NOD 樣受體有5 個亞家族，分別為NLR（A、B、C、P 和X），其中NLRC 及NLRP 是其主要類型，NOD1、NOD2 是NLRC 亞家族研究最多的2 個成員。NOD1、NOD2 均由3 個結構域組成，分別為位于羧基末端LRR 結構域，位于分子中間NBD 結構域及位于氨基末端EBD 結構域，這些結構域通過識別配體、寡聚化及介導蛋白質之間相互作用，將信號傳遞給下游通路。另外NOD1 及NOD2 均含有半胱氨酸募集結構域。NOD 樣受體自發現以來，均作為先天性免疫應答的一部分參與細菌入侵細胞后信號轉導。后續研究發現NOD 樣受體與炎癥密切相關，炎癥是眾多腫瘤發生的重要驅動因素，因此學者開始關注NOD 樣受體在腫瘤中的作用〔6，7〕。

Wang 等〔8〕采用免疫組化檢測NOD1 信號通路在正常口腔、癌前病變和口腔惡性腫瘤中的表達，結果表明隨著NOD1 隨著OSCC 的進展而降低。NOD1 的表達與腫瘤分化、淋巴結轉移和腫瘤大小密切相關。莊媛媛等〔9〕研究表明NOD1 蛋白表達于細胞質，舌鱗狀細胞癌組織中NOD1 蛋白表達率為60.0%顯著低于正常舌黏膜對照組表達率80.0%，舌鱗狀細胞癌組織NOD1 mRNA 表達量為正常舌黏膜對照組（0.437±0.103）倍。本研究結果與研究報道一致〔8，9〕，NOD1 在OSCC 組織中低表達，同時臨床病理參數分析結果說明NOD1 參與OSCC 的發生發展及轉移。

莊園等〔10〕研究表明NOD2 蛋白表達于細胞質，舌鱗癌組織NOD2 蛋白表達率為64.0%（16/25），顯著低于正常舌黏膜組織的表達率〔84.0%（21/25，P＜0.05）〕。舌鱗癌組織NOD2 mRNA 表達量為正常舌黏膜組織的（0.521±0.080）倍。而且過表達NOD2 可促進Tca8113 舌鱗癌細胞凋亡，抑制其增殖〔11〕。本研究與莊園等〔10〕研究結果一致，說明低表達的NOD2 促進OSCC 的發生。

Da Silva Correia 等〔12〕研究發現NOD1 敲除或者過表達的人乳腺癌細胞（SK-BR）-3、人巨噬細胞趨化因子（MCF）-7 乳腺癌細中，NOD1 均能調控細胞的凋亡通路，而且移植瘤小鼠實驗發現NOD1 對于雌激素敏感的腫瘤具有抑制作用，但NOD1 對該細胞系無顯著影響。Chan 等〔13〕發現白細胞介素（IL）-8 能夠通過趨化因子受體（CXCR）1/2 介導的NOD1/信號通路中受體相互作用蛋白（RIP）2 信號通路進而促進頭頸部鱗癌的發展，NOD2 卻對此癌癥進展無任何影響。Yoon 等〔14〕卻證實NOD1 在YD-10B 口腔鱗癌細胞中高表達，NOD2 低表達，且NOD2 激動劑MDP 以劑量依賴的方式抑制YD-10B細胞的增殖。說明NOD1、NOD2 在不同的腫瘤組織、細胞中起的作用不大相同。而本研究說明低表達的NOD1、NOD2 促進OSCC 的發生發展。提示NOD1 及NOD2 可能可作為OSCC 診斷及惡性程度判斷的有效指標。